Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Біохімічні методи

Метод використовують для діагностики спадкових хвороб обміну речовин.

Об’єктами біохімічної діагностики можуть бути сеча, піт, плазма і сироватка крові, Кров, висушена на хроматографічному або фільтрувальному папері, Спинномозкова рідина, амніотична рідина, культура клітин (фібробласти, лімфоцити).

Якщо специфічний дефект ферменту призводить до накопичення метаболітів з низькою молекулярною масою і високою проникністю, вони можуть виходити у міжклітинний простір. Низькомолекулярні метаболіти можуть бути ідентифіковані в плазмі крові або сечі за допомогою різних методів: інгібіція росту бактерій, тонкошарова, газова або рідинна хроматографія, спектрометрія та ін.

Якщо метаболіти мають велику молекулярну масу, вони накопичуються в клітинах, спричинюючи збільшення органоїдів і появу вакуолей. Захворювання, пов’язані з порушенням катаболізму великих молекул, діагностуються шляхом визначення активності ферментів у тканинах або клітинах.

Принципи біохімічної діагностики грунтуються на патогенезі ферментопатій. Вони можуть бути спрямовані на визначення таких показників:

— надмірної кількості речовини, метаболізм якої порушений;

— аномальних метаболітів у крові та сечі;

— дефіциту нормальних метаболітів;

— активності ферменту, що відповідає за метаболічний шлях.

Диференціальна Діагностика ферментопатій за клінічною картиною, особливо у новонароджених і дітей раннього віку, утруднена, оскільки схожу клінічну картину можуть мати різні ферментопатії. Це зумовило необхідність створення спеціальних діагностичних тест-програм.

Біохімічну діагностику, як правило, проводять в два етапи: 1) первинна діагностика (скринінг); 2) уточнення діагнозу.

Скринінг може бути селективним або масовим.

Селективний біохімічний скринінг проводиться серед груп дітей і дорослих з клінічними ознаками спадкового дефекту обміну речовин для виявлення незвичайних метаболітів або їх надлишкового накопичення та виділення. Основна мета скринінгу полягає у відборі індивідів для подальшого уточнення діагнозу. Іншими словами, йдеться про «просіювання» спеціальних контингентів дітей або дорослих, серед яких можна з високою вірогідністю чекати виявлення хворих із спадковими хворобами обміну.

Рис. 10.15. Папілярні узори на пальцях. Дуги а — мікроаномалія розвитку, часто симптом хромосомної патології. У нормі зустрічаються завитки б і петлі в, г

Показання для селективного скринінгу:

— затримка психомоторного розвитку у дітей раннього віку, розумова відсталість у дітей старшого віку;

— неврологічні порушення (судоми, зниження м’язового тонусу, спастичні парези);

— диспептичні явища, непереносимість окремих продуктів і ліків, порушення вигодовування;

— порушення фізичного розвитку дітей (затримка збільшення маси тіла та росту, деформація кісток тулуба і кінцівок тощо);

— інші симптоми ферментопатій (катаракта, порушення слуху, зору, специфічний колір і запах сечі, шкірні прояви та ін.).

У селективних програмах можуть використовуватися якісні та напівкількісні Методи, як матеріал — сеча або кров.

При підозрі на наявність спадкової патології обміну речовин у першу чергу проводиться сечовий скринінг. Для цього використовують 15-20 простих якісних реакцій, які охоплюють максимально широке коло метаболічних дефектів. Ці реакції спрямовані на виявлення деяких метаболітів, які, як правило, характерні для цілої групи захворювань (табл. 10.3).

При підозрі на порушення певної ланки метаболізму проводиться діагностика за допомогою тонкошарової хроматографії амінокислот, ліпідів, вуглеводів та олігосахаридів, а також кількісне визначення глікозаміногліканів і сечової кислоти в сечі.

Інколи для скринінгу досліджують кров. Так, методом електрофорезу виявляють дефекти обміну гемоглобіну (гемоглобінопатії); при підозрі на Мітохондріальні хвороби визначають вміст пірувату і лактату; тонкошарова хроматографія амінокислот використовується для діагностики аміноацидурій.

Кінцевий етап біохімічної діагностики — це точна верифікація захворювання. Для уточнення діагнозу використовують кількісні високотехнологічні методи біохімічної діагностики. Так, для виявлення спадкових порушень обміну органічних кислот, жирних кислот, амінокислот, мітохондріальних хвороб використовують методи газової хроматографії та мас-спектрометрії; для визначення амінокислотного спектра крові та сечі — амінокислотний аміноаналізатор; для діагностики хвороб обміну органічних кислот, амінокислот, мітохондріальних хвороб, порушення циклу сечовини — кількісну рідинну хроматографію; для визначення рівня оротової кислоти в сечі, для діагностики порушення обміну сечової кислоти — колориметричний метод. Для діагностики низки хвороб корисними є хроматографія на іонообмінних смолах, метод газорідинної хроматографії та інші. Активність ферменту може досліджуватися в культурі клітин (лізосомні хвороби, мукополісахари- доз).

Для підтвердження діагнозу можуть використовуватися не тільки біохімічні, але й цитохімічні, молекулярно-генетичні методи, біопсія тканин і органів з подальшим дослідженням гістологічних препаратів під світловим або електронним мікроскопом тощо.

Таблиця 10.3. Приклади простих якісних експрес-тестів, використовуваних для сечового скринінгу

Масовий скринінг — це масове обстеження всіх новонароджених з метою раннього виявлення на доклінічній стадії захворювання, для якого розроблено методи профілактичного Лікування. Раннє лікування запобігає розвитку клінічних ознак хвороби.

Основні вимоги до скринінгових програм для масового неонатального скринінгу:

1. Висока частота захворювання в популяції. Оскільки частота певних спадкових хвороб обміну варіює у різних популяціях, перелік захворювань може відрізнятись у різних країнах та етнічних групах. У більшості випадків скринуються захворювання, що зустрічаються в популяції з частотою 1:10 000 і частіше (іноді — менш розповсюджені захворювання).

2. Захворювання без своєчасного лікування призводить до тяжких порушень здоров’я, ранньої інвалідизації.

3. Повинні існувати способи профілактичного лікування.

4. Методи діагностики мають бути високочутливими (не повинні давати хибнонегативних результатів), специфічними (допускається невеликий відсоток хибнопозитивних результатів), економічними; біологічний матеріал для діагностики має бути доступним. У більшості програм досліджують кров.

5. Тип успадкування хвороби та її Патогенез повинні бути чітко з’ясовані, для родини можливе Медико-генетичне консультування.

6. Витрати на скринінг-програми не повинні перевищувати витрат на лікування й утримання хворих, які стали інвалідами внаслідок даного захворювання.

Програма обов’язково містить такі етапи: 1) взяття біологічного матеріалу для дослідження у всіх новонароджених і доставка матеріалу в діагностичну лабораторію; 2) лабораторна просіваюча діагностика; 3) уточнююча діагностика всіх випадків з позитивними результатами при просіюванні; 4) лікування хворих і їхня Диспансеризація з контролем за ходом лікування; 5) медико-генетичне консультування сім’ї.

Програми масового скринінгу на СПАДКОВІ ХВОРОБИ, що піддаються профілактичному лікуванню, можуть запроваджуватися тільки у межах державної або регіональної системи охорони здоров’я.

Першу програму масового скринінгу новонароджених на фенілкетонурію розробив Гатрі (США) в 1961 р. У багатьох країнах сьогодні проводиться скринінг новонароджених на фенілкетонурію і гіпотиреоз (для них характерна висока частота, при ранній діагностиці та лікуванні забезпечується формування нормального фенотипу). В деяких країнах скринують галактоземію (частота 1:50 000, але захворювання добре лікується при своєчасній діагностиці). До захворювань, для яких розроблено програми масового скринінгу, належать також адреногенітальний синдром, муковісцидоз і деякі спадкові хвороби обміну речовин, що рідко зустрічаються (гомоцистинурія, тирозинемія, гістидинемія, «хвороба кленового сиропу» та ін.).

В Україні проводиться Масовий скринінг новонароджених на фенілкетонурію. З урахуванням частоти, ефективності профілактичного лікування, економічної значущості патології впроваджується проведення масового неонатального скринінгу вродженого гіпотиреозу.

Скринінг на фенілкетонурію. На 3-тю-5-ту добу у новонароджених беруть кров на спеціальний хроматографічний або фільтрувальний папір (картки Гатрі). Кров висушують, зразок пересилають в лабораторію, що займається скринінговими дослідженнями. Одна і та ж картка з плямами крові може використовуватися для скринінгу багатьох спадкових захворювань.

Для скринінгу можна використовувати 3 методи: 1) мікробіологічний тест Гатрі; 2) тонкошарову хроматографію амінокислот крові; 3) флуориметричний метод.

Тест Гатрі мікробіологічний. У планшети висівають бактерії Bacillus subtilis на середовище з антиметаболітом фенілаланіну. На цьому середовищі бактерії не ростуть. З плями висушеної крові вирізують кружальця (диски) діаметром 2 мм. Кружальця розкладають на живильне середовище. У крові є фенілаланін, тому навколо плями крові спостерігається ріст бактерій, інтенсивність якого залежить від кількості фенілаланіну. Метод Гатрі якісно-напівкількісний, дозволяє визначити концентрацію фенілаланіну вище 4 мг/дл.

Метод тонкошарової хроматографії (ТШХ) також якісно-напівкількісний, визначає концентрацію ФА вище 4 мг/дл, технічно відносно простий і дешевий, дозволяє діагностувати не тільки фенілкетонурію, а й інші аміноацидурії.

Флуориметричний метод — папір з кров’ю вміщують у спеціальний розчин і додають барвник нінгідрин, який з фенілаланіном дає бузкове забарвлення. Інтенсивність забарвлення залежить від кількості фенілаланіну і визначається за допомогою спеціального приладу — флюороскана. Цей метод є кількісним, найточнішим, дозволяє визначити концентрацію фенілаланіну, його використовують у більшості лабораторій.

У разі позитивного результату проводиться уточнююча біохімічна діагностика. Деякі форми гіперфенілаланінемії перебігають доброякісно і не потребують лікування.

Скринінг на вроджений гіпотиреоз. Скринінг грунтується на визначенні вмісту в крові тироксину (у хворих знижений) або тиреотропного гормону (ТТГ — збільшений) у висушеній плямі крові на фільтрувальному папері. Взяття крові проводиться в ті ж терміни, що і для діагностики феніл-кетонурії. Для діагностики можуть використовуватися радіоімунні або імуноферментні (імунофлуоресцентні) методи. Через технічні та економічні причини імуноферментним методам віддається перевага.

Скринінг на адреногенітальний синдром (вроджену гіперплазію надниркових залоз). Найчастішою причиною хвороби є мутація гена, що кодує фермент 21-гідроксилазу. Метод скринінгу грунтується на виявленні збільшення вмісту 17-а-оксипрогестерону у висушеній плямі крові на фільтрувальному папері. Розроблено радіоімунні та імуноферментні (переважаючі) методи.

Для скринінгу галактоземії використовують мікробіологічний або біохімічний тести, які визначають вміст галактози в крові.

Скринінг муковісцидозу грунтується на визначенні високого вмісту імунореактивного трипсину в крові. Методів профілактичного лікування муковісцидозу не існує, але рано розпочата терапія істотно збільшує тривалість життя хворого. Тому скринінг доцільно проводити в країнах з високою частотою популяції муковісцидозу (на Півдні України — це одне з найпоширеніших моногенних захворювань, частота 1:1600).

Слід пам’ятати, що процедура скринінгу не забезпечує остаточного діагнозу, оскільки для скри- нінгу використовуються високочутливі реакції, які інколи можуть давати хибнопозитивні реакції. Як і у разі селективного скринінгу, необхідно провести Другий етап — повторне обстеження і підтвердження діагнозу за допомогою високочутливих кількісних методів.