Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Цитогенетичні методи
Метод каріотипування

Дозволяє вивчити каріотип у цілому (тобто кількість і структуру хромосом). Хромосоми людини вивчають на стадіях метафази і прометафази мітозу.

1. Вивчення метафазних хромосом. У цій стадії хромосоми максимально спіралізовані та добре помітні у Світловий Мікроскоп. Препарат метафазних хромосом однієї клітини називається метафазною пластинкою. Для діагностики більшості хромосомних хвороб метафазні пластинки виготовляють з лімфоцитів периферичної крові. Придатні також фібробласти шкіри, клітини червоного кісткового мозку. Для пренатальної діагностики культивують клітини амніотичної рідини, ворсин хоріона, плаценти, ембріональні Тканини. Використовують також клітини різних тканин абортованих ембріонів.

Метафазні пластинки з лімфоцитів периферичної крові одержують таким чином.

Для каріотипування використовують венозну Кров (1-2 мл). Її вміщують у спеціальне живильне середовище (Середовище 199, «Игла» та ін.) з фітогемаглютиніном (ФГА) — білок бобових рослин. Він спричинює бластну трансформацію лімфоцитів і їхній поділ шляхом мітозу. Культуру вміщують у термостат на 48-72 год.

За 2-3 год до кінця культивування додають колхіцин (або колцемід). Колхіцин одержують із рослини пізньоцвіту осіннього, або лугового шафрану (Colchicum autumnale). Він руйнує веретено поділу і зупиняє поділ клітини на стадії метафази.

Наступний етап виготовлення препарату — обробка клітин гіпотонічним розчином хлориду калію або цитрату натрію. У гіпотонічному розчині клітини набухають, міжхромосомні зв’язки рвуться і хромосоми вільно плавають у цитоплазмі. Клітинну суспензію фіксують і наносять на предметне скло. При висиханні фіксатора клітини і хромосоми міцно прикріплюються до скла.

Препарат забарвлюють ядерними барвниками. Розрізняють Методи рутинного і диференціального забарвлення. При рутинному методі препарат забарвлюють азур-еозином за Романовським— Гімзою. При цьому всі хромосоми забарвлюються рівномірно за всією довжиною (рис. 10.1). Рутинне забарвлення дозволяє підрахувати кількість хромосом, розподілити їх по групах і виявити грубі Хромосомні аберації. Для деяких діагностичних цілей (наприклад, для виявлення кількісних аномалій хромосом) цей метод цілком достатній. Для отримання детальнішої картини структури хромосом і точної діагностики хромосомної аберації використовуються різні способи диференціального забарвлення.

Вперше методику диференціального забарвлення хромосом запропонував Caspersson (1968). Сьогодні використовують чотири основні методи диференціального забарвлення: G-, R-, Q-, C-забарвлення.

Найчастіше використовують G-забарвлення (від англ. Giemsa stain). Хромосоми перед забарвленням за Романовським — Гімзою заздалегідь обробляють протеазами (трипсином), після чого вони стають смугастими. В них чергуються темні та світлі смуги (див. рис. 1.7). Поперечні смуги, що виявляються при диференціальному забарвленні, називаються сегментами. Припускають, що темні смуги (G-смуги) — це ділянки гетерохроматину, а світлі (R-смуги) — еухроматину. Зазвичай у гаплоїдному наборі можна налічити 200-400 сегментів на гаплоїдний набір. Підраховано, що кожний сегмент містить близько 8 млн п. н. Чергування темних і світлих смуг (сегментів) індивідуальне в кожній парі хромосом. Розроблено форму представлення стилізованого ідеального каріотипу з типовим рисунком смуг на кожній хромосомі. Схематично узагальнення каріотипу з графічним зображенням окремих хромосом набору з усіма їх структурними характеристиками називається ідіограмою (рис. 10.2).

R-забарвлення (від англ. reverse banding — зворотне забарвлення). Препарат перед забарвленням за Романовським — Гімзою заздалегідь нагрівають у сольовому розчині до 78-90 °С. При цьому хромосоми також мають поперечну посмугованість. Рисунок смуг зберігається, але їх колір змінюється на протилежний порівняно з G-забарвленням, тобто темні смуги стають світлими і навпаки. Звідси назва методу — reverse banding (зворотне забарвлення).

Q-забарвлення (від англ. quinacrine — квінакрин, акрихін, один із флюоресцентних барвників) — історично перший метод, розроблений Каспер- соном (Caspersson, 1968). При цьому методі хромосоми забарвлюють флюоресцентними барвниками і вивчають за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Як барвники нині використовують акрихін, акрихін-іприт та ін. Сегменти, що яскраво світяться при Q-забарвленні, еквівалентні темно забарвленим смугам при G-забарвленні.

С-забарвлення (від англ. constitutive heterochromatin — конститутивний гетерохроматин). Препарати обробляють лугами, а потім забарвлюють за Романовським — Гімзою. При цьому добре забарвлюються центромери всіх хромосом, довге плече Y-хромосоми та інші ділянки, багаті на гетерохроматин.

Рис. 10.1. Нормальний хромосомний набір чоловіка, рутинне забарвлення (метафазна пластинка і розкладка хромосом; можлива ідентифікація хромосом 1, 2, 3, 16 і Y)

Слід підкреслити, що названі методи не є альтернативними. У 1971 р. на Паризькій конференції було порівняно дані, одержані при різних методах диференціального забарвлення. Встановлено, що всі методи виявляють у принципі одні й ті самі структури, але кожен з них специфічний щодо певних хромосомних сегментів (рис. 10.3).

2. Вивчення прометафазних та профазних хромосом (диференціальне забарвлення з високою роздільною здатністю). Сьогодні розроблено Методики виготовлення препаратів прометафазних та профазних хромосом, коли хромосоми ще недостатньо конденсовані. Такі хромосоми довші, ніж хромосоми на стадії метафази. При диференціальному забарвленні прометафазних і профазних хромосом можна розглянути від 550 до 850 сегментів на гаплоїдний набір. При цьому сегменти, які спостерегаються в метафазних хромосомах, можна підрозділити на субсегменти (рис. 10.4). Цей метод використовують для діагностики мікроделецій, мікродуплікацій і складних хромосомних аберацій.