Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Цитогенетичні методи
Молекулярно-цитогенетичні методи

Це Методи, які поєднують традиційні цитогенетичні Методики з молекулярно-генетичними технологіями. Основним є метод флюоресцентної гібридизації in situ (FISH-метод).

Методика містить гібридизацію in situ (тобто в препараті, на предметному склі) забарвлених флюоресцентними барвниками ДНК-зондів із метафазними або інтерфазними хромосомами.

Class="center">

Рис. 10.2. Схематичне зображення диференціального G-забарвлення хромосом

Рис. 10.3. Узагальнене схематичне зображення диференціального забарвлення хромосом за Q-, C-, R-методами

Рис. 10.4. Диференціальне забарвлення Хромосоми 18 різного ступеня конденсації (справа метафазна хромосома з рівнем розділення 400 сегментів на гаплоїдний набір, посередині та зліва — прометафазні хромосоми з рівнем розділення 550 сегментів і 850 сегментів на гаплоїдний набір відповідно)

Зонд — це ділянка одноланцюжкової ДНК, комплементарна певній ділянці гена або хромосоми. Зондами можуть служити послідовності ДНК, виділені з геному, штучним чином синтезовані або клоновані за допомогою бактеріальних плазмід або іншими способами. Для FISH-методу зонди мітять біотином або дигоксигеніном, до яких потім приєднуються флюоресцентні барвники.

Метод складається з таких етапів:

1. Готують препарат метафазних або прометафазних хромосом.

2. Препарат обробляють лугами. При цьому відбувається денатурація ДНК, тобто розриваються водневі зв’язки між двома ланцюгами ДНК.

3. На скло краплями наносять ДНК-зонди. Зонд з’єднується з комплементарними послідовностями ДНК хромосом, відбувається так звана гібридизація. Гібридизація — це з’єднання за принципом комплементарності нуклеїнових кислот, виділених із різних джерел (у даному випадку відбувається гібридизація ДНК пацієнта з ДНК зонда).

4. Препарат відмивають від надлишку зонда. Гибридизовані зонди залишаються фіксованими на хромосомах. Препарат обробляють флюоресцентними барвниками, які приєднуються до біотину або дигоксигеніну. Як барвники можна використати родамін (дає червоне світіння) або флюоресцеїн ізотіоціанат (зелене світіння).

5. Препарат вивчають під люмінесцентним мікроскопом. Ділянки хромосом, де відбулася гібридизація і де знаходяться зонди, дають специфічне світіння.

Нині FISH-метод використовують також для вивчення хромосом у клітинах, що не діляться, на стадії інтерфази (рис. 10.5).

У клінічній генетиці метод використовують для швидкої діагностики в інтерфазних ядрах хромосомних хвороб, пов’язаних зі зміною кількості хромосом, а також для діагностики мікроделецій,

мікродуплікацій і складних хромосомних перебудов, які за допомогою звичайних цитогенетичних методів виявляються рідко.

Розроблено різні типи зондів:

а) зонди до певного локусу хромосоми (гена). Використовують для діагностики мікроделецій або мікродуплікацій. Наприклад, зонди до певної ділянки довгого плеча 15-ї хромосоми використовують для діагностики синдромів Ангельмана і Прадера — Віллі.

Такі зонди використовують також для картування хромосом. При цьому зонди можуть бути виготовлені на основі мРНК, виділених із тканин;

б) зонди до теломер. Синтезований повний набір зондів до теломер усіх 24 хромосом людини (22 автосоми плюс Х- і Y-хромосоми). Використання цих зондів дозволило виявити невеликі субтеломерні делеції і транслокації у частини дітей з незрозумілою раніше розумовою відсталістю;

Рис. 10.5. FISH-метод (інтерфазні клітини хворого з синдромом Дауна, оброблені зондами до 21-ї хромосоми; видно три зони флюоресценції)

в) набір зондів до різних локусів однієї і тієї ж хромосоми. Якщо їх використовують одномоментно, то можна «забарвити» хромосому цілком. Цей метод дозволяє діагностувати транслокації невеликих ділянок хромосом, виявити природу кільцеподібних або маркерних хромосом;

г) зонди до центромер певних хромосом. Так, синтезовано зонди до центромер 13, 18, 21-ї, Х- і Y-хромосом. Їх використовують для швидкої пренатальної діагностики найбільш розповсюджених хромосомних синдромів в інтерфазних клітинах ворсин хоріона або амніотичної рідини. Принцип методу такий, як і для метафазних пластинок. Готується препарат клітин амніотичної рідини або ворсин хоріона на предметному склі. Препарат денатурують лугами і потім обробляють зондами до центромер певної хромосоми (наприклад, 21-ї). У нормі соматичні клітини мають дві хромосоми 21. В ядрі під люмінесцентним мікроскопом будуть помітні дві точки, які флюоресціюють відповідним кольором. Якщо у плода Синдром Дауна, то в ядрі будуть помітні 3 точки (рис. 10.5). Метод простий і потребує мало часу (кілька годин).

Модифікації FISH-методу

Метод зворотного мічення (reversepainting). У деяких випадках у клітинах можуть виявлятися додаткові фрагменти деяких хромосом у вигляді кільцеподібної або маркерної хромосоми. Щоб встановити її походження, хромосому виділяють, потім її ДНК ампліфікують за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції. Для ампліфікації використовують НУКЛЕОТИДИ з радіоактивним ізотопом ³²Р. Одержані ДНК з радіоактивною міткою гібридизують з хромосомами нормальної метафазної пластинки. Походження додаткового сегмента встановлюють за хромосомою, з якою гібридизувалася мічена ДНК.

Метод порівняльної геномної гібридизації. (CGH — comparative genomic Hybridization). Використовується в онкогенетиці для виявлення в пухлині ділянок хромосом, які ампліфікувалися (це свідчить про активацію онкогенів) або піддалися делеції (що свідчить про втрату відповідного гена-супресора). Суть методу в тому, що виділяють ДНК з пухлини («тестована ДНК»), ампліфікують за допомогою ПЛР і мітять флюоресцентним барвником. ДНК, виділену з нормальної Тканини, мітять іншим барвником. Потім готують за стандартною методикою метафазну або прометафазну пластинку (для FISH-методу). Суміш тестованої та нормальної ДНК гібридизують з хромосомами. Ділянки пухлинної ДНК, в яких відбулася делеція (втрата генів) або ампліфікація (збільшення кількості генів), визначають за зміною інтенсивності світіння.

Спектроскопічний аналіз хромосом (багатоколірне спектральне каріотипування — multicolour spectral karyotyping). У FISH-методі використовуються набори зондів до різних локусів всіх хромосом. Зонди мітять різними флюоресцентними барвниками. Каріотип обробляють набором таких зондів. Кожна пара хромосом має специфічні спектральні характеристики. Після комп’ютерної обробки спектра кожна пара хромосом набуває специфічного забарвлення. Оскільки кожна пара має специфічний колір, у такому каріотипі легко розпізнаються найскладніші Хромосомні аберації. Метод переважно використовується в онкогенетиці, оскільки він дозволяє точно описати множинні структурні перебудови хромосом, що відбуваються в пухлинних клітинах. Широке використання методу в клінічній генетиці обмежується його високою вартістю.