Анатомія рослин: практикум - Панюта О.О. 2019

Додатки
Мікрохімічні реакції

До складу рослинної клітини входять різноманітні органічні сполуки, їх визначають за допомогою спеціальних методів хімічного аналізу, які дають можливість досить точно визначити їхню кількість на певному етапі розвитку рослини.

В анатомії рослин часто виникає необхідність визначити лише наявність будь-якої органічної сполуки. В таких випадках застосовують мікрохімічні реакції, що дають можливість за допомогою кольорових реакцій встановити наявність в клітинах різних речовин, а саме: вуглеводів, білків, алкалоїдів, жирних кислот, дубильних речовин та багатьох інших сполук.

Мікрохімічні реакції дають можливість швидко визначити наявність будь-якої речовини методом забарвлення, який ґрунтується на тому, що певні речовини забарвлюються у відповідний колір, коли впливати на них тими чи іншими реактивами.

якісні реакції на вуглеводи

Реакція Подобєдова-Моліша застосовується для якісного визначення вуглеводів. З досліджуваного матеріалу вижимають кілька краплин клітинного соку в пробірку і додають дві краплі 10%-вого спиртового розчину альфанафтолу. Потім до цієї суміші обережно доливають по стінках пробірки 2 або 3 мл концентрованої сірчаної кислоти так, щоб вона не змішувалась з рідиною і падала на дно. Згодом, на межі двох рідин утворюється кільце червоно-фіолетового кольору, причому інтенсивність забарвлення швидко зростає. Таку реакцію дають усі вуглеводи.

Реакція Селіванова. З досліджуваного рослинного матеріалу вижимають 50 мл клітинного соку, який протягом 10 хвилин нагрівають у пробірці в киплячій бані з 10 мл резорцину та з 10 мл 1 Н розчину соляної кислоти. Якщо в досліджуваному матеріалі є гексози, то виникає яскраво червоне забарвлення.

Реакція з дифеніламіном. До 50 мл вижатого клітинного соку, який виливають у колбочку, додають 1 мл води, 0,5 мл 20%-вого розчину дифеніламіну в 96%-вому спирті та 1 мл 25%-вої соляної кислоти. Суміш нагрівають протягом 5 хвилин в киплячій водяній бані. Після виникнення забарвлення продовжують підігрівати ще протягом 5 хвилин. Утворення інтенсивного синього забарвлення свідчить про присутність органічних сполук - кетоз.

Рідину Фелінга використовують як реактив на глюкозу, а також на відновлювальні цукри - фруктозу і мальтозу.

Для визначення цукру препарат кидають у пробірку або кладуть на предметне скло в певну кількість рідини Фелінга, до якої додають у два рази менше води. Потім препарат разом з рідиною нагрівають. Якщо в ньому є цукор, то через деякий час випадає осад закису міді цегляно-червоного кольору.

Наявність цукру можна виявляти за допомогою фелінгової рідини іншим способом. У цьому разі спочатку препарат кладуть в насичений розчин мідного купоросу, потім промивають водою і обробляють киплячим розчином, такого складу: 100 мл води, 10 г сегнетової солі та 11 г їдкого калі. У деяких випадках можна обходитись і без сегнетової солі; тоді після мідного купоросу препарати кладуть у гарячий розчин їдкого калі.

Хлор-цинк-йод застосовують для того, щоб віднімати від целюлози хімічно зв’язану воду. При цьому відбувається перетворення целюлози в амілоїд.

Фосфорну кислоту використовують разом з розчином йоду в йодистому калії. Цей реактив придатний для визначення целюлози. Під його впливом целюлоза перетворюється в амілоїд і забарвлюється в фіолетовий колір.

Мікрохімічні реакції на білки

Для визначення наявності білків застосовують такі реакції: ксантопротеїнову, біуретову, Мілонову, Распайля, реакцію на сірку.

Ксантопротеїнова реакція. До досліджуваного розчину додають міцної азотної кислоти і підігрівають на спиртівці. Згодом виникає жовте забарвлення, яке при додаванні розчину аміаку або лугу переходить в оранжеве забарвлення.

Біуретова реакція. Наявне хроматичне ядро, з яким азотна кислота утворює нітросполуку жовтого кольору. Ця реакція властива для всіх білків, за винятком протамінів, в молекулі яких немає бензольного ядра. Ця реакція обумовлюється тим, що в молекулі білка присутні групи - СООН, внаслідок чого може виникати забарвлення навіть з небілковими речовинами, якщо вони мають таку групу. Біуретова реакція властива для всіх білків, для пептонів та пептидів.

До розчину білка доливають міцного лугу і додають кілька краплин сірчанокислої міді невеликої концентрації. Через деякий час виникає фіолетове забарвлення. Пептони та поліпептиди дають червоний відтінок.

Цю саму реакцію можна проробити інакше: до 10 мл розчину, в якому є білок, додають 2,5 мл 33%-вого розчину їдкого натру, добре перемішують і до суміші додають 1 мл 0,2% розчину сірчанокислої міді, який обережно опускають по стінках пробірки.

На межі двох рідин, що стикаються одна з одною, утворюється фіолетове кільце.

Реакція Мілона. До розчину білка додають реактив Мілона, для виготовлення якого беруть 1 мл металічної ртуті і розчиняють в 9 мл азотної кислоти, питомої ваги 1,52. До цього розчину додають рівний об’єм води.

Розчин білка з реактивом Мілона залишають на 20-30 хвилин або обережно підігрівають. Згодом виникає м’ясо-червоне забарвлення. Зазначена реакція властива майже для всіх білків, що мають бензольне ядро, в якому є гідроксил. Деякі протаміни та желатина не дають реакції з реактивом Мілона, тому що в їхній молекулі немає тирозину.

Реакція Распайля. Виготовляють тоненькі зрізи з насіння пшениці. Насіння перед цим намочують у воді до набубнявіння. Виготовлені зрізи кладуть на предметне скло в краплю розчину цукру, до якого додають сірчаної кислоти і злегка підігрівають. Через деякий час виникає червоний колір. Коли зрізи розглядають під мікроскопом, вони мають рожевий колір.

Реакція на сірку. Сірка входить до складу білкових сполук. Щоб пересвідчитись у цьому, до розчину білка додають однаковий об’єм 40%-вого розчину їдкого натру та кілька крапель міцного розчину оцтовокислого свинцю. Суміш обережно підігрівають до кипіння. Спочатку утворюється білий осад, який поступово буріє і навіть чорніє. Зазначена реакція обумовлюється тим, що в молекулі білка є сірка. Їдкий натр застосовують тому, що він руйнує білок, причому виділяється сірка у вигляді сірководню, який зі свинцем дає чорний осад сірчистого свинцю. Ця реакція властива для всіх білків, за винятком желатини та протамінів.

Реакція на жири

Реактивом на жири може бути судан-ІІІ, під впливом якого жири забарвлюються в рожевий колір. Цей же реактив застосовують безпосередньо на зрізах у тих випадках, коли треба відокремити кутикулу від клітинної стінки. Кутикула від судану-ІІІ забарвлюється інтенсивніше в червоний колір, ніж кутинізована клітинна стінка.

Спеціальним реактивом на жири є алканін. Це речовина, яка забарвлює корінь рослин алькани та деяких інших рослин з родини шорстколистих у червоний колір. Для виготовлення цього реактиву корінці алькани кладуть у спирт, щоб мати спиртову витяжку; утворений спиртовий настій фільтрують. В ньому є алканін, який забарвлює в червоний колір жири, смоли, кутикулу та корок. Жири забарвлюються цим реактивом зразу, а корок та кутикула через деякий час.

Реакцію на жири дає також осмійова кислота, утворюючи чорне або буре забарвлення.

Реакція на алкалоїди

Алкалоїди осаджують за допомогою, так званих, алкалоїдних реактивів, найважливішими з яких є:

Жовта кров’яна сіль. Під впливом підкислених розчинів цієї солі більшість алкалоїдів утворюють кристалічні осади.

Насичений водний розчин пікринової кислоти утворює осади, які складаються з алкалоїдів.

Йод в йодистому калії. Під впливом такого розчину алкалоїди утворюють коричнево-червоні осади.

Бром та бромистий калій. Спочатку готують 10%-вий водний розчин бромистого калію, а потім насичують його бромом.

Під впливом такого розчину алкалоїди утворюють оранжеві та коричневі осади, що мають кулястий вигляд.

Фосфорно-молібденова кислота. Готують 10%-вий водний розчин, під впливом якого алкалоїди утворюють білі та жовті осади.

Подвійна сіль йодної ртуті та йодистого калію. В 1 л води розчиняють 49,8 г йодистого калію, до якого додають 13,5 г йодної ртуті. Під впливом цього реактиву алкалоїди утворюють білі або жовтуваті, здебільшого, аморфні осади.

Проводячи мікрохімічні реакції на алкалоїди, треба користуватись кількома реактивами, тому що аналогічні реакції з утворенням осаду дають і інші речовини.

Реакція на леткі кислоти жирного ряду

До складу рослин входять різні органічні кислоти. Присутність деяких з них можна визначити за допомогою кольорових реакцій.

Розчин мурашиної кислоти, нейтралізований їдким натром, дає з азотнокислим сріблом білий осад, який швидко темніє під час нагрівання і відновлюється до металічного срібла.

В присутності азотної кислоти мурашина кислота або її солі легко відновлюють хромову кислоту. Для проведення цієї реакції беруть 3-4 мл 0,5%-вого розчину К₂Сr₂О₇ в міцній азотній кислоті і додають одну краплину хромової кислоти або кілька її кристалів. На холоді швидко виникає синьо-фіолетове забарвлення.

Солі мурашиної кислоти з оцтовокислим свинцем дають кристалічний осад. За нагрівання він розчиняється, а за охолодження знову кристалізується у вигляді маленьких блискучих голочок.

Присутність масляної кислоти визначають так: у разі нагрівання солей масляної кислоти з сірчаною кислотою спостерігається специфічний запах згірклого масла. Якщо її солі підігрівати в присутності кількох краплин спирту та концентрованої сірчаної кислоти, то виникає запах масляно етилового ефіру, який нагадує запах ананаса.

Реакція на дубильні речовини

Дубильні речовини дають кольорові реакції з багатьма сполуками. Щоб визначити в рослині присутність дубильних речовин, намочують кору дуба або іншої рослини і одержують настій. Профільтрувавши його, додають кілька крапель 1%-вого розчину хлорного заліза або залізного галуну. Перед цим треба пересвідчитись, що реакція настою нейтральна. Якщо в настої є дубильні речовини, то виникає синє або зеленувате забарвлення.

Інші реакції на дубильні речовини пов’язані з утворенням осадів. Так, при реакції з хромпіком, коли зрізи кладуть на предметне скло в краплю двохромовокислого калію (1:10), дубильні речовини випадають в густий сірий або червоно-бурий осад. Якщо до розчину дубильних речовин додавати оцтовокислого свинцю або солей інших важких металів, то теж випадає осад.

Хлористий барій вживають для відокремлення кристалів сірчанокислого кальцію від щавлевокислого кальцію. Коли впливати на зрізи розчином хлористого барію, то кристали щавлевокислого кальцію не змінюються, а кристали сірчанокислого кальцію розчиняються. Цей же реактив придатний для визначення наявності сірки. Найкращим препаратом будуть зрізи кореня хрону. Якщо обробляти зрізи розчином хлористого барію, то можна спостерігати утворення кристалів сірчанокислого барію. В ці кристали переходить сірка як мінеральних, так і органічних сполук, що є в досліджуваних препаратах.

Реакцію з флороглюцином застосовують для виявлення здерев’янілих клітинних стінок, а також для визначення пентоз.

У разі визначення пентоз беруть розчин з розтертих яблук з таким розрахунком, щоб він містив 10 мг пентоз. До розчину додають таку ж кількість 36%-вої соляної кислоти, а потім грудочку флороглюцину завбільшки з просяне зерно. Суміш нагрівають в киплячій водяній бані протягом кількох хвилин. Через деякий час виникає фіолетово-червоне забарвлення, яке свідчить про наявність пентоз.

Флороглюцин застосовують і для визначення здерев’яніння пагонів. Для цього з них роблять тоненькі зрізи, кладуть їх у краплю розчину флороглюцину і додають краплю соляної кислоти. Здерев’янілі елементи забарвлюються в рожевий або червоний колір.

Флороглюцинова реакція дає можливість виявити ті зміни, які виникають у паренхімі деревини та в судинах.

Реакція з сірчанокислим аніліном. Цей реактив використовують для визначення здерев’янілих стінок. Під його впливом здерев’янілі стінки забарвлюються в яскраво-жовтий колір.

Хлоралгідрат - найкращий реактив для просвітлювання різних рідин та препаратів. Він просвітлює значно краще, ніж жавельова вода. Просвітлювання відбувається внаслідок того, що під впливом реактиву білки розчиняються. Виготовляють його так: 5 г кристалічного звичайного хлоралгідрату розчиняють у 2 мл води, цей же реактив застосовують для просвітлення пилкових зерен та насінних зачатків.