Анатомія рослин: практикум - Панюта О.О. 2019

Додатки
Фарбування препаратів

Кислий фуксин. Кислий фуксин належить до анілінових барвників. Під його впливом відбувається забарвлення цитоплазми, білкових кристалів, пластид, особливо лейкопластів. Перед фарбуванням досліджувані препарати треба спочатку зафіксувати протягом доби в насиченому розчині сулеми в абсолютному спирті. Фарбування триває 24 години, після чого препарат ретельно промивають звичайною водою і розглядають у гліцерині. Для виготовлення кислого фуксину беруть 0,2 г фуксину на 100 мл дистильованої води. Під впливом цього реактиву цитоплазма забарвлюється в червоний колір.

Еозин. Еозин застосовують для диференційованого фарбування препаратів. Під впливом цього барвника пектинові речовини залишаються незабарвленими, а крохмальні зерна, жири та смоли забарвлюються мало. Добре забарвлюються еозином конституційні та запасні білки. Якщо проводити подвійне фарбування еозином та метиленовою синькою, то цитоплазма забарвлюється в червоний колір, а ядро, ядерце та хроматин - в темно- синій. У цьому випадку виготовляють спочатку 1%-вий водний розчин еозину і в нього кладуть досліджувані препарати на 5-7 хвилин, після промивання впродовж 25 хвилин витримують в 4%- вому водному розчині метиленової синьки.

Їдкий калій. Розчини їдкого калію впливають на різні складові частини клітин неоднаково. Наприклад, крохмальні зерна під його впливом клейстеризуються, жири омилюються, білкові речовини розчиняються і в результаті препарат просвітлюється. Під впливом розчину їдкого калію розчиняються міжклітинні плас- тинки. Цей процес особливо швидко відбувається у разі нагрівання. Внаслідок цього відбувається мацерація.

Фарбування карміном проводиться в розчинах цієї фарби. Виготовляють кілька типів барвників, а саме: галуновий кармін, оцтовокислий кармін та борний кармін.

Галуновий кармін. Використовують для фарбування ядер. Щоб забарвлення було чисте, препарати промивають 5%-вим розчином галуну, а потім дистильованою водою.

Борний кармін. Забарвлені цією фарбою препарати промивають підкисленим спиртом. Для цього на 100 мл спирту додають 3 краплі міцної соляної кислоти. Така фарба дуже стійка.

Можна виготовити інші галунові карміни, наприклад за таким рецептом: 1 г кармінової кислоти та 10 г галуну на 200 мл дистильованої води. Все це розчиняють за нагрівання, потім фільтрують, додавши до розчину 0,20 г саліцилової кислоти.

Фарбування гематоксиліном. Фарбування гематоксиліном застосовують у різних комбінаціях. Є кілька способів виготовлення цього барвника. З них найпоширеніші такі:

1. Беруть 3%-вий розчин залізоаміачного галуну і 10%-вий розчин гематоксиліну в абсолютному спирті, який зберігають у темноті і перед застосуванням розчиняють у 9 частинах дистильованої води.

Предметне скло зі зрізами досліджуваних об’єктів поміщають у розчин галуну на 2 години, а потім переносять в посудину з водогінною водою, яку міняють кілька разів. Після цього галун споліскують з предметного скла, бо коли галуну багато, він псує гематоксилін. Цю процедуру треба виконувати дуже швидко, щоб не вимити галун із зрізу. Потім препарати кладуть у розчин гематоксиліну на 2-2,5 години. Якщо вони пролежали в гематоксиліні досить часу, а дальшу їх обробку доводиться відкладати, то в таких випадках препарати можна зберігати в 96%-вому спирті. Коли обробку препарату закінчують, то залишок гематоксиліну змивають звичайною водою. Нижню сторону предметного скла теж треба сполоснути. Під мікроскопом зріз матиме чорне забарвлення.

2. З кристалічного гематоксиліну за звичайної температури виготовляють насичений спиртовий розчин. Паралельно з цим, за звичайної температури виготовляють насичений водний розчин аміачного галуну. Після цього беруть 4 мл першого розчину і 150 мл другого і зливають їх в хімічний стакан або колбу з широким горлом. Щоб у посуд краще проникало повітря для окиснення, його закривають марлею або фільтрувальним папером (щоб не потрапляв пил) і залишають на світлі протягом 6-8 діб. Потім рідину фільтрують і до фільтрату додають 22 мл гліцерину та 22 мл метилового спирту. Цей розчин залишають на світлі, його можна застосовувати лише через півтора-два місяці, коли з нього виділиться увесь осад.

Залізогематоксиліновим методом можна фарбувати мітохондрії. Для цього зрізи з досліджуваних об’єктів залишають у розчині галуну на 2-3 доби, потім виймають, швидко прополіскують і кладуть на 2 доби у гематоксилін. За цей час зрізи дуже перезабарвлюються. Диференційоване забарвлення відбувається звичайним способом. Під мікроскопом перевіряють, як відбулося диференційоване забарвлення. Для цього зрізи накривають накривним скельцем. Коли саме припиняти диференціювання, можна виявити і за малого збільшення, якщо є навички у цій роботі. При вдалому забарвленні мітохондрій ядро буде забарвлене сильніше.

Препарати можна фарбувати і гематеїновим галуном.

Для цього 1 г гематеїну, розчиняють за нагрівання в 50 мл 90%-вого спирту і змішують з розчином 50 г галуну в 1 л дистильованої води. До цієї суміші доливають 20 мл льодяної оцтової кислоти. Гематеїновий галун можна зберігати довго, але треба мати на увазі, що він дає осад на склі, а тому фарбу треба брати піпеткою з середини склянки. Зрізи фарбують протягом кількох хвилин. Після цього промивають, спочатку 1%-вим розчином галуну, потім дистильованою водою і, нарешті, водогінною. Зразу ж після промивання зрізи стають синіми.

Метиленовий синій. Ця фарба забарвлює препарати в світло-синій колір. Від метиленового синього різні елементи забарвлюються з неоднаковою швидкістю та інтенсивністю.

Фуксин дає дуже стійке червоне забарвлення, його застосовують у водних розчинах в концентрації 0,2 частини за вагою фуксину на 100 частин води.

Сафранін. 1 г сафраніну розчиняють у 100 мл води. Через кілька годин розчин придатний до використання. Від сафраніну стінки клітин забарвлюються від рожевого до червоного кольору, залежно від ступеня здерев’яніння.

Сафранін та яскрава зелень. Для виготовлення розчину яскравої зелені в 70-90%-вому спирті розчиняють таку її кількість, щоб рідина здавалась яскраво-зеленою. На кожні 100 мл розчину додають 2 краплі концентрованої соляної кислоти. Препарати на 8-10 годин кладуть у сафранін, а потім прополіскують водою. Підкислений розчин яскравої зелені одночасно фарбує і диференціює попереднє забарвлення. З розчином яскравої зелені працюють так само, як і з підкисленим спиртом, тобто його наливають на скло з препаратом, яке злегка похитують. Забарвлення та диференціювання контролюють під мікроскопом. Після того як ядра забарвляться в червоний колір, а цитоплазма в зелений, фарбування припиняють. Кислоту вимивають 96%-вим спиртом і кладуть препарат в гвоздичну олію, щоб видалити спирт.

Для подвійного фарбування використовують суміш фуксину з метиленовою зеленню. У цьому разі обидві фарби розчиняють окремо в 50%-вому спирті. Потім до розчину метиленової зелені поступово додають розчин фуксину доти, поки він стане фіолетовим. Під впливом цієї суміші утворюється подвійне забарвлення, а саме: цитоплазма клітини забарвлюється в червоний, а клітинні стінки - в зеленуватий або блакитний колір.