Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики)
Прямі і непрямі методи ДНК-діагностики

Молекулярно-генетичні Методи поділяються на прямі та непрямі.

Пряма Діагностика передбачає виявлення Мутації в досліджуваному гені. Вона має практично абсолютну точність, потребує для аналізу тільки зразок ДНК обстежуваної особи і може проводитися як у сімейних, так і спорадичних випадках захворювань. Для проведення прямої ДНК-діагностики необхідно точно знати структуру гена (або конкретної ділянки гена, що містить аналізовану мутацію). Пошук мутацій, які спричинили захворювання, — це складне завдання, оскільки захворювання може бути зумовлене різними мутаціями одного і того ж гена. Проте, як правило, у конкретній популяції частіше зустрічається певний тип мутацій. Мутації, які переважають і зумовлюють значний відсоток усіх випадків захворювання в даній популяції, називаються мажорними мутаціями. Так, більшість випадків фенілкетонурії зумовлена мутацією R408W у гені, відповідальному за захворювання, муковісцидоз найчастіше зумовлений мутацією гена білка хлорного каналу AF508, Експансії тринуклеотидних повторів — при синдромі ламкої Х-Хромосоми, делеції — при міодистрофії Дюшенна, протяжна делеція — при адрено-генітальному синдромі тощо. Знання мажорних мутацій полегшує проведення прямої ДНК-діагностики.

Методичні підходи, які використовуються при прямій ДНК-діагностиці того чи іншого спадкового захворювання, залежать від характеру мутацій і молекулярної організації відповідного гена.

У прямій діагностиці використовують методи ПЛР. Застосовуючи праймери до ділянки гена, в якій найчастіше відбувається мутація, одержують велику кількість копій даної ділянки. Подальше вивчення продуктів ПЛР залежить від типу мутації. Так, якщо захворювання зумовлене делецією нуклеотидів, дуплікацією або експансією тринуклеотидних повторів, то ампліфіковані фрагменти нормального і мутантного генів відрізняються за довжиною і електрофоретичною рухливістю. В цьому випадку після електрофорезу фрагментів у агарозному гелі проводять аналіз поліморфізму довжин ампліфікованих фрагментів (ПДАФ) (див. рис. 10.8). Для виявлення нуклеотидних замін в аналізованій ділянці гена виникає необхідність секвенування ампліфікованих фрагментів. Для детекції мутації можуть використовуватися й інші Методики. У деяких випадках мутації порушують сайти рестрикції для певних рестриктаз. У мутантному гені може бути відсутнім сайт рестрикції для певної рестриктази або, навпаки, з’являється сайт рестрикції в незвичному місці. В обох ситуаціях мутантний і нормальний ПЛР-продукт дадуть різні за довжиною фрагменти рестрикції, що можна легко виявити при електрофорезі (ПДРФ — поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів).

Для прямої діагностики використовують різні модифікації ПЛР, а також Інші методи ДНК-діагностики — блот-гібридизацію за Саузерном, трансляцію білкового продукту in vitro та ін.

Непряма діагностика використовується при захворюваннях, коли ген картований (відома його локалізація в хромосомі), але будова гена, характер мутацій у ньому недостатньо з’ясовані. Суть непрямої ДНК-діагностики полягає в аналізі успадкування у хворих і здорових членів сім’ї поліморфних генетичних маркерів, зчеплених з Геном хвороби (тобто розташованих у сусідніх локусах у хромосомі й успадкованих зчеплено — за законом Моргана). В якості таких маркерів можуть бути сайти рестрикції для певних рестриктаз, поліморфізм мінісателітних і мікросателітних послідовностей.

Сайти рестрикції можуть розташовуватися поряд із патологічним геном у некодуючих ділянках ДНК. Для людини характерний однонуклеотид- ний поліморфізм ДНК — у некодуючих ділянках ДНК часто зустрічаються однонуклеотидні заміни, делеції. Вони можуть торкатися сайтів рестрикції, зчеплених з патологічним геном. При цьому змінюється довжина рестрикційних фрагментів ДНК (поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів).

Мікросателітні ДНК — короткі тандемні повтори з 2-6 (частіше 2-4) нуклеотидів. Найпоширенішими є динуклеотидні ЦА-повтори. Вони розташовуються тандемно кластерами (тобто групами один за одним, наприклад, ЦАЦАЦА....). Часто зустрічаються три-, тетра- і пентануклеотидні тандемні повтори — STR (short tandem repeats). Кількість повторів в одному і тому ж локусі може істотно відрізнятися у різних людей. Отже, і довжина кластерів поліморфна. Мікросателіти знаходяться переважно в некодуючих ділянках ДНК, тому фенотипічно зміна кількості повторів не виявляється. Вони успадковуються за законами Менделя. Дитина одержує одну хромосому від матері з певною кількістю повторів, другу від батька — з іншою кількістю повторів. Якщо поряд із геном, відповідальним за моногенне захворювання, або всередині гена знаходиться такий кластер мікросателітів, то маркером патологічного гена може бути певна кількість повторів і довжина кластера. В даному випадку діагностика базується на вивченні довжини коротких тандемних повторів ДНК (STR).

Мінісателітні ДНК — тандемні повтори більшої кількості нуклеотидів (15-100). Вони дістали назву VNTR (variable number tandem repeats) — тандемні повтори, варіюючі за кількістю. Довжина цих локусів також істотно варіює у різних людей і може бути маркером патологічного гена. У ДНК часто зустрічаються кластери мінісателітних тандемних повторів 10-15 нуклеотидів, які вперше знайшов англійський генетик Джеффриз (Jeffreys). Використовуються рідше, ніж мікросателітні ДНК.

Недоліком непрямих методів є обов’язкове попереднє вивчення генотипу хоча б одного хворого родича, щоб можна було встановити зчеплення патологічного гена з певним поліморфним маркером. У разі відсутності уражених родичів, доступних для обстеження, проведення діагностики, як правило, неможливе. При проведенні непрямої ДНК-діагностики завжди існує вірогідність помилки, пов’язаної з можливою рекомбінацією в мейозі між геном хвороби і досліджуваним маркером, внаслідок чого «патологічний» маркерний алель і ген хвороби у нащадка розійдуться по різних хромосомах. Величина такої помилки прямо пропорційна відстані між маркерним локусом і геном, що вивчається: чим ближче вони один до одного в хромосомі, тим менше вірогідність розходження внаслідок кросинговеру. Для відомих сьогодні генетичних маркерів, які використовуються у непрямій ДНК-діагностиці спадкових захворювань, вірогідність кросинговеру з геном хвороби не перевищує 1-5 %. Таким чином, точність непрямої ДНК-діагностики становить зазвичай 95 % і вище.

Непрямі методи можуть також застосовуватися при захворюваннях, гени яких ідентифіковані, але мають великий розмір і складну молекулярну організацію, у зв’язку з чим безпосереднє визначення мутацій у них утруднене. Прикладами таких захворювань з розшифрованими генами, для яких використовується непряма ДНК-діагностика, можна назвати атаксію-телеангіектазію, хворобу Коновалова — Вільсона та ін.