ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

6. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ ДРОЖЖЕЙ

Цель работы: ознакомление с морфологией культурных дрожжей, используемых в пивоварении и хлебопечении, и диких дрожжей, вызывающих порчу пищевых продуктов.

Дрожжи относятся к эукариотам и являются одноклеточными микроскопическими грибами. На основании характера полового процесса или его отсутствия дрожжи относят к трем классам высших грибов - аскомицетам, базидиомицетам и дейтеромицетам.

Класс аскомицетов (Ascomycetes) включает три семейства дрожжей: Saccharomycetaceae, Schizosaccharomycetaceae и Saccharomycodaceae. Характерными признаками грибов этого класса являются половое спороношение и наличие в асках (сумках) двух, четырех или восьми аскоспор.

В пищевой и микробиологической промышленности широко используются дрожжи рода Saccharomyces из семейства Saccharomycetaceae. Сахаромицеты применяются при производстве спирта, вина, пива, кваса, хлеба, хлебопекарных дрожжей. В пивоварении используют различные штаммы дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, в хлебопечении - дрожжи видов Saccharomyces cerevisiae и Candida milleri (ранее Saccharomyces minor).

Некоторые представители семейства Saccharomycodaceae (родов Nadsonia, Saenko) участвуют в брожении при производстве хересных и шампанских вин. Все остальные виды дрожжей являются посторонними («дикими»), контаминирующими биотехнологический процесс на разных его стадиях.

Несовершенные дрожжи класса дейтеромицетов (Deuteromycetes) - это либо анаморфы известных аскомицетовых или базидомицетовых грибов, либо виды, для которых половая стадия не установлена или она отсутствует. В этом классе выделяют семейство Сandidaceae c признаками аскомицетового аффинитета и два семейства - Cryptococcaceae (не образуют баллистоспор) и Sporobolomycetaceae (образуют баллистоспоры) - с признаками базидиомицетового аффинитета. Дрожжи родов Candida и Trichosporon способны образовывать псевдомицелий.

6.1. Характеристика некоторых видов культурных и диких дрожжей

Дрожжи представляют собой одноклеточные эукариотные микроорганизмы, размножающиеся почкованием, спорообразованием или бинарным делением. Размеры клеток дрожжей, используемых в пищевой промышленности, колеблются от 3 до 6 мкм в поперечнике и от 8 до 12 мкм в длину.

Для изучения морфологии дрожжей их выращивают в стерильном солодовом сусле с концентрацией сухих веществ от 8 до 10 % или в глюкозопептонной среде при температуре 25-28 °С в течение 2-3 сут.

Форма вегетативных клеток разных видов дрожжей весьма разнообразна. Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования. Клетки дрожжей могут иметь округлую, овальную, яйцевидную, реже цилиндрическую, лимоновидную (апикулятную) форму. У несовершенных дрожжей клетки имеют более характерную форму: стреловидную (род Brettanomyces), треугольную (род Trigonopsis), серповидную (род Selenotila), колбовидную (род Schizoblastosporion). У дрожжей родов Candida и Trichosporon наряду с округлыми и овальными клетками в препарате встречаются длинные клетки псевдомицелия.

Культурные дрожжи

Вид Saccharomyces cerevisiae (рис. 6.1).

Рис. 6.1. Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae: а - молодые клетки; б - зрелые; в - старые

Морфологические признаки. Клетки дрожжей данного вида имеют овальную, округлую, яйцевидную или слегка удлиненную форму размером (5-6) х (9-14) мкм. Цитологические особенности дрожжевой клетки могут существенно изменяться в зависимости от ее возраста. Новая молодая клетка развивается либо из споры при ее прорастании, либо образуется вегетативно при почковании.

Молодые активные клетки дрожжей (12-18-часовая культура) при микроскопировании имеют тонкую прозрачную оболочку и гомогенную, без видимых включений, цитоплазму, небольшую вакуоль. Иногда в цитоплазме встречаются одно-два зернышка полифосфатов. Молодые дрожжи интенсивно размножаются, при этом доля почкующихся клеток может достигать 70-80 %.

Зрелые дрожжи (24-48-часовая культура) имеют зернистую неоднородную или гетерогенную цитоплазму. Количество клеток с вакуолями увеличивается, иногда обнаруживаются клетки с двумя и более вакуолями. Процесс размножения дрожжей замедляется; процент почкующихся клеток составляет в среднем 10-15 %. Внутри клетки появляются жировые включения, которые хорошо видны без специального окрашивания при полузакрытой диафрагме. В зрелых дрожжах встречается до 2-4 % мертвых клеток, которые выявляются с помощью прижизненного окрашивания суспензии дрожжей слабым раствором метиленового голубого. Метиленовый голубой проникает в цитоплазму только через оболочку мертвых клеток, в результате чего они окрашиваются в голубой цвет, тогда как живые клетки остаются бесцветными. Доля запасных веществ - липидов, гликогена - возрастает по мере роста клетки. Для зрелой культуры дрожжей характерно наличие в клетках большого количества гликогена. Он откладывается в вакуолях как резервное вещество и расходуется по мере старения клетки. При культивировании дрожжей на богатых углеводами средах без аэрации количество клеток с гликогеном составляет 65-70 %, что свидетельствует об «упитанности» и зрелости дрожжей. Гликоген выявляют путем окрашивания прижизненных препаратов дрожжей раствором йода. Наряду с гликогеном в зрелых дрожжах накапливается еще одно резервное вещество - метахроматин (волютин), который окрашивается в краснофиолетовый цвет при окрашивании фиксированного препарата дрожжей метиленовым голубым.

Старые дрожжи (48 ч и более) имеют утолщенную оболочку, которая хорошо видна при микроскопировании. Цитоплазма зернистая, гетерогенная, вакуоли крупные, по нескольку в одной клетке. В популяции старой культуры присутствует большое количество клеток, содержащих липиды в виде круглых, резко преломляющих свет включений. Характерным признаком старой культуры является наличие значительного количества мертвых клеток.

Существенные цитологические изменения происходят при изменении условий культивирования: переходе от аэробного процесса к анаэробному, замене состава среды и концентрации лимитирующих веществ, а также при стрессовых физиологических воздействиях.

В аэробных условиях дрожжи интенсивно размножаются, клетки более мелкие и однородные, митохондрии в них активно делятся, число их заметно возрастает.

В условиях анаэробного брожения митохондрии объединяются, в клетках накапливается больше гликогена, и он выглядит в виде крупных гранул.

Культуральные признаки. Колонии на сусло-агаре белые, круглой формы, с ровными краями и выпуклым центром, с гладкой тускло-блестящей поверхностью, диаметром 0,5 — 1,0 см. При росте на жидком солодовом сусле дрожжи этого вида образуют небольшой осадок желтовато-белого цвета.

Вид Candida milleri (ранее Saccharomyces minor). Дрожжи этого вида являются специфическими для ржаного теста.

Морфологические признаки. Клетки мелкие, круглые, диаметром 1,5 — 3,0 мкм с характерным почкованием: почки располагаются на одном из концов клетки. При выращивании дрожжей в жидкой среде почки образуются на обоих концах клеток или по две почки на одном конце.

Культуральные признаки. На сусло-агаре вырастают мелкие серовато-белые колонии с ровными краями и приподнятым центром, диаметром от 0,4 до 0,8 см. Поверхность колоний гладкая, блестящая. В солодовом сусле образуют небольшой осадок серовато-белого цвета, который при взбалтывании легко взмучивается.

Дрожжи, вызывающие порчу пищевых продуктов

Наряду с культурными дрожжами в биотехнологических процессах могут встречаться так называемые «дикие» дрожжи, которые конкурируют с культурными за питательные вещества субстрата и вызывают порчу или ухудшение органолептических показателей готового продукта. Чаще всего среди «диких» встречаются дрожжи родов Saccharomyces, Kloecera, Саndida, Torulopsis, Pichia, Hansenula, Brettanomyces, Rhodotorula и некоторые другие.

Вид Saccharomyces pastorianus (рис. 6.2, а) - клетки эллипсовидные или колбасовидные, реже овальной формы. Не оседают с культурными дрожжами при главном брожении пива, при их размножении пиво мутнеет, плохо осветляется, приобретает неприятный запах, терпко-горький привкус.

Вид Saccharomyces turbidans (рис. 6.2, б) - клетки овальной или эллипсовидной формы, часто соединяются в цепочки по 4-5 клеток. В пиве вызывают сильную муть, порчу вкуса.

Вид Kloecera apiculata (рис. 6.2, в) - клетки мелкие, лимоновидные, заостренные на одном или двух полюсах, располагаются одиночно, реже парами. При старении приобретают вытянутую веретенообразную форму. Размеры клеток (5-8) х (2-4) мкм. При развитии в пиве накапливают летучие кислоты, эфиры и сероводород, придавая продукту неприятный специфический запах.

Вид Saccharomyces bayanus (рис. 6.2, г) - клетки крупные, овальные. Обнаруживаются в пиве, сидре, виноматериалах. Они придают готовому продукту неприемлемые вкус и запах в связи с образованием значительных количеств эфиров, диацетила, уксусной кислоты, серосодержащих летучих кислот.

Saccharomyces validus (рис. 6.2, д) - клетки овальные или сильно удлиненные, располагаются попарно или небольшими скоплениями. Вызывают помутнение пива и неприятный специфический запах.

Вид Hansenula anomalia (рис 6.2, е) - клетки круглые, эллипсовидные, иногда колбасовидные или булавовидные. Дрожжи рода Hansenula образуют большое количество спиртов и эфиров, придавая пиву резкий запах. Подавляют развитие культурных дрожжей.

Вид Pichia farinosa (рис. 6.2, ж) - клетки округлые, овальные, располагаются одиночно или соединены в пары. Размеры клеток (4,0-7,5) х (3-6) мкм. Дрожжи этого вида, а также вида P. membranifaciens образуют на поверхности пива белую пленку. Накапливают в продукте альдегиды, эфиры, летучие кислоты, придающие пиву фруктовый или лекарственный привкус. При доступе воздуха во время розлива размножаются и вызывают помутнение пива.

Рис. 6.2 (а - г). Некоторые представители диких дрожжей (Т.П. Слюсаренко, 1984): а - Saccharomyces pastorianus; б - Saccharomyces turbidans; в - Kloecera apiculata; г - Saccharomyces bayanus

Вид Brettanomyces bruxellensis (рис. 6.2, з) - клетки имеют разную форму: овальную, сильно удлиненную, палочковидную, иногда со стрельчато-заостренными концами. B. bruxellensis контаминируют сусло и пиво. Развитие этих дрожжей сопровождается появлением в пиве постороннего фруктового запаха и помутнения. Другие

виды (В. anomalus, В. intermedius) вызывают порчу пастеризованного пива, придавая ему специфический неприятный запах.

Рис. 6.2 (д - к). Некоторые представители диких дрожжей (Т.П. Слюсаренко, 1984): д - Saccharomyces validus; e - Hansenula anomalia; ж - Pichia farinose; з - Brettanomyces bruxellensis; и - Candida mycoderma; к - Torulopsis colliculosa

Род Candida. Основные представители этого рода - C. mycoderma (рис. 6.2, и), C. utilis, C. krusei, C. guillermondii - имеют клетки овальные или удлиненно-цилиндрические. Размеры клеток (4-16) х (2-5) мкм. Дрожжи этого рода не образуют спор и являются аспорогенными. Многие представители этого рода являются вредителями в производстве вина, пива, пекарских дрожжей. На поверхности сусла и пива часто образуют плотную белую или сероватую сухую пленку. Вызывают помутнение пива, придают ему неприятный вкус и запах.

В процессе накопления биомассы при производстве пекарских дрожжей дрожжи рода Candida конкурируют с культурными дрожжами за питательные вещества субстрата, снижают мальтазную активность готовых дрожжей.

Род Torulopsis. Клетки дрожжей рода торулопсис мелкие, округлые или овальные, размерами (5-8) х (2-5). Дрожжи этого рода часто выделяют из кефирных грибков (Torulopsis kefiri).Дрожжи вида Torulopsis colliculosa (рис. 6.2, к) являются вредителями пивоваренного и дрожжевого производства.

Вид Rhodotorula roseum - клетки округлые или овальные, одиночные, соединенные в пары, псевдомицелия не образуют. Размеры клеток (5-8) х (2,5-5,0) мкм. На питательном агаре R.. roseum образует круглые блестящие колонии розового цвета. При размножении на поверхности пищевых продуктов вызывают их пигментацию.

6.2. Определение содержания мертвых и почкующихся клеток в суспензии дрожжей

Морфологическое состояние дрожжей определяют путем микроскопирования. С этой целью проводят подсчет числа почкующихся и мертвых клеток.

Определение количества мертвых клеток. Содержание мертвых клеток - важный показатель качества пивных и пекарских дрожжей. В дрожжах хорошего качества должно содержаться не более 5 % мертвых клеток. Увеличение количества мертвых клеток указывает на наличие неблагоприятных факторов при выращивании дрожжей. При значительном количестве мертвых клеток возможны нарушения технологического процесса: медленное брожение, развитие посторонних видов микроорганизмов.

При определении количества мертвых клеток дрожжей, культивируемых на неокрашенных питательных средах, удобно окрашивать их метиленовым голубым. Для этого готовят раствор красителя на дистиллированной воде в разведении 1:10000. Препарат готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю исследуемой культуры, добавляют в нее каплю раствора метиленового голубого и накрывают покровным стеклом. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с увеличением 90х. Мертвые клетки окрашиваются в голубой цвет, а живые остаются бесцветными. В 10 полях зрения приготовленного препарата подсчитывают число мертвых клеток (В).

Определение количества почкующихся клеток. На предметное стекло наносят каплю исследуемой суспензии дрожжей, добавляют каплю метиленового синего, размешивают и накрывают покровным стеклом. Рассматривают с объективом 60х или 90х. В поле зрения препарата общее число не должно превышать 30-40. В каждом поле зрения подсчитывают число почкующихся клеток (С) и общее число клеток (А). Почкой считают клетку, которая по величине не превосходит 1/2 материнской клетки. Клетку с почкой, размер которой меньше 1/3 материнской, считают за одну. При активном размножении дрожжей число почкующихся клеток достигает 50 % и более. Малое количество почкующихся форм указывает на низкую активность размножения дрожжей. Подсчет общего количества и почкующихся клеток проводят не менее чем в 10 полях зрения.

Результаты опыта заносят в табл. 6.1 и рассчитывают процентное содержание мертвых и почкующихся клеток в исследуемой суспензии дрожжей.

Таблица 6.1. Результаты подсчета клеток дрожжей в 10 полях зрения

Число клеток

Поля зрения

Среднеарифметическое значение А, В, С

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

А - общее

В - мертвых

С - почкующихся

Содержание мертвых клеток в исследуемой суспензии дрожжей:

X = В/А • 100, %.

Содержание почкующихся клеток в исследуемой суспензии дрожжей:

У = С/А • 100, %.

6.3. Окрашивание запасных питательных веществ, содержащихся в дрожжевых клетках

Окрашивание гликогена. В молодых культурах дрожжей откладывается большое количество запасного питательного вещества - гликогена. В нормально «упитанных» дрожжах от 70 до 75 % клеток содержат гликоген. Меньшее количество клеток с гликогеном в производственных дрожжах свидетельствует о старости дрожжевых клеток или о недостаточном их питании.

Для обнаружения гликогена на предметное стекло наносят пипеткой каплю суспензии дрожжей, добавляют небольшое количество раствора йода. Суспензию накрывают покровным стеклом, на него наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет, клетки дрожжей бесцветны.

Окрашивание липидов. В старых культурах дрожжей обычно накапливается большое количество липидов. Синтез липидов у дрожжей сахаромицетов имеет место при избытке углеводного питания, интенсивной аэрации и отсутствии азота в питательной среде. Липиды синтезируются также при наличии ингибиторов в среде.

1-й метод. Для окрашивания липидов на предметное стекло пипеткой наносят каплю суспензии дрожжей, в нее добавляют каплю спиртового раствора краски Судан III и накрывают покровным стеклом. На стекло палочкой наносят кедровое масло и микроскопируют с объективом 90х. Капли жира окрашены в желтый цвет, а клетки дрожжей бесцветны.

2-й метод. На предметное стекло наносят небольшую каплю 40 %-го раствора формалина. Петлей в каплю вносят культуру дрожжей. Формалин убивает клетки и делает оболочку более проницаемой. Через 5 мин добавляют небольшую каплю метиленового синего, еще через 10 мин - каплю Судана III. Препарат накрывают покровным стеклом, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсионным объективом. Цитоплазма окрашивается в синий цвет, а капельки жира - в розовооранжевый.

Окрашивание полифосфатов по Леффлеру. Полифосфаты часто называют также метахроматиновыми зернами или зернами во- лютина. Для обнаружения полифосфатов готовят фиксированный препарат дрожжей и окрашивают его метиленовым синим. В вакуолях полифосфаты окрашены в красно-фиолетовый цвет. Цитоплазма дрожжевых клеток окрашивается в голубой цвет.

6.4. Спорообразование у дрожжей

Аскоспорогенные дрожжи в неблагоприятных условиях могут образовывать аскоспоры. Для спорообразования необходимы определенные условия:

• молодой возраст культуры (предварительное выращивание на богатых средах в течение 1-2 суток;

• высев активно растущих дрожжей на голодные среды (среда Городковой);

• инкубация на голодной среде в течение 2-4 недель при температуре несколько ниже оптимальной (20-25 °С) при еженедельном микроскопировании.

В дрожжевой клетке или в аске образуется от 1 до 8 аскоспор.

Окрашивание спор дрожжей. Для окрашивания спор берут культуру дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae, выращенную предварительно в течение 2 недель на среде Городковой. Готовят фиксированный препарат, заливают его карболовым фуксином Циля и нагревают в течение 2-3 мин в пламени спиртовки до появления паров. Затем препарат обесцвечивают, погружая его в 2 %-й раствор молочной кислоты или в 95 %-й этанол, содержащий 1 % концентрированной соляной кислоты. Препарат промывают водой и докрашивают в течение 3-5 мин 1 %-м раствором метиленового синего, после чего снова промывают водой и осушают фильтровальной бумагой. На препарат наносят иммерсионное масло и рассматривают с объективом 90х.

Зрелые аскоспоры окрашиваются в красный цвет, вегетативные клетки - в синий.

Среда Городковой для образования аскоспор содержит в 1 л водопроводной воды (г): пептон -10, хлорид натрия - 5,0; глюкоза - 1,0; агар - 20. Устанавливают рН среды 7,3 и стерилизуют в течение 15 мин при давлении 0,1 МПа.

Контрольные вопросы

1. Какие виды дрожжей используют в производстве пива, вина, хлеба?

2. Какие виды дрожжей являются вредителями пивоваренного и хлебопекарного производств?

3. Каковы морфологические признаки молодых, старых и мертвых клеток дрожжей?

4. Какие запасные питательные вещества содержатся в цитоплазме дрожжевых клеток? Как их можно обнаружить?

5. При каких условиях дрожжи образуют споры?