ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

7. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИИ БАКТЕРИИ

Цель работы: ознакомиться с морфологией бактерий.

При определении вида бактерий (идентификации) используют совокупность признаков, в том числе морфологических (от греч. morphus - форма), к которым относятся форма и размеры клеток, окрашивание по Граму, подвижность (наличие или отсутствие жгутиков), способность образовывать эндоспоры и капсулы.

7.1. Формы бактерий

По внешнему виду различают три основные формы бактерий: шаровидные (кокки), палочковидные (цилиндрические) и извитые (рис. 7.1). Среди извитых форм бактерий встречаются возбудители инфекционных заболеваний, поэтому они являются объектами изучения медицинской микробиологии.

Шаровидные бактерии имеют форму правильного шара, но некоторые из них по форме напоминают свечу, ланцет, бобы, кофейное зерно. В зависимости от расположения клеток (после деления) кокки подразделяют на:

микрококки (от греч. micros - малый) - одиночные или беспорядочно расположенные клетки;

диплококки (от греч. diplos - двойной) - располагаются парами, так как клетки после деления не расходятся (лактококки);

стрептококки (от греч. streptos - витой, плетеный) - клетки округлой или вытянутой формы, составляющие цепочку вследствие деления клеток в одной плоскости и сохранения связи между ними;

тетракокки (от греч. tetra - четыре) - сочетания по четыре кокка;

сарцины (от лат. sarcia - соединяю) - пакеты кокков, образующиеся при делении их в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и состоящие из 8 или более клеток;

стафилококки (от греч. staphyle - виноградная гроздь) - скопления клеток, напоминающие гроздья винограда в результате деления в разных плоскостях;

гонококки (возбудители гонореи) имеют форму кофейных зерен, соединенных по два и обращенных друг к другу вогнутыми сторонами;

пневмококки и менингококки по форме напоминают пламя свечи и располагаются попарно широкими основаниями вовнутрь.

Рис. 7.1. Основные формы бактерий (Воробьев и др., 1994): 1 - стафилококки; 2 - стрептококки; 3 - сарцина; 4 - гонококки; 5 - пневмококки; 6 - капсула пневмококков; 7 - коринебактерии дифтерии; 8 - клостридии; 9 - бациллы; 10 - вибрионы; 11 - спириллы; 12 - трепонемы; 13 - боррелии; 14 - лептоспиры; 15 - актиномицеты; 16 - расположение жгутиков: а - монотрихи; б - лофотрихи; в - амфитрихи; г - перитрихи

Палочковидные бактерии имеют цилиндрическую форму различной длины и диаметра и различаются также по форме концов клетки и взаимному расположению клеток. Концы палочек бывают обрезанными (сибиреязвенная палочка), заостренными (фузобактерии), закругленными (кишечная палочка), имеющими утолщения на концах и напоминающие булаву (коринебактерии дифтерии).

Палочки могут располагаться одиночно, парами, цепочками, частоколом, розеткой. Среди палочковидных бактерий встречаются виды, образующие эндоспоры - бациллы 8 (от лат. bacillus - палочка) и клостридии (от греч. closter - веретено), и не образующие спор - бактерии (псевдомонады, кишечные палочки, сальмонеллы, палочки протея и др.)

Возбудители дифтерии, относящиеся к роду коринебактерий, характеризуются наличием на концах палочек зерен полифосфатов. Палочки, образующие ветвистые формы, относят к микобактериям (микобактерии туберкулеза, актиномицеты, бифидобактерии).

Извитые бактерии. К извитым формам относятся:

вибрионы (от лат. vibrio - изогнутый) - слегка изогнутые палочки, по форме напоминающие запятую (холерный вибрион);

кампилобактеры - клетки имеют изгибы, как у крыла чайки;

спириллы - слабо извитые формы, клетки имеют 3-5 завитков;

спирохеты - сильно извитые формы - тонкие, длинные, извитые клетки со множеством завитков. Среди спирохет встречаются виды, патогенные для человека. Это представители родов лептоспира (Leptospira), трепонема (Treponema), боррелия (Borrelia).

7.2. Окрашивание бактерий по Граму

Все бактерии по этому признаку разделяются на две группы:

• красящиеся по Граму - грамположительные;

• не красящиеся по Граму - грамотрицательные.

В основе метода лежат различия в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий.

Сущность метода основана на различии в химическом составе и строении клеточной стенки бактерий.

Техника окрашивания бактерий по Граму

1. На обезжиренное предметное стекло нанести в трех местах три капли воды и приготовить три тонких мазка разных видов бактерий: по краям контрольные (с заведомо известным отношением их к окраске по Граму), а в центре - мазок исследуемой культуры.

2. Мазки высушить и зафиксировать в пламени спиртовки.

3. Мазки окрасить в течение 1 мин генцианвиолетом (положить на предметное стекло полоску фильтровальной бумаги, пропитанной красителем, и смочить ее водой).

4. Бумажку с красителем удаляют и, не промывая препарат водой, наносят на него раствор Люголя. Выдерживают в течение 1 мин (до полного почернения мазка).

5. Препарат, не промывая водой, обрабатывают 96 %-м спиртом в течение 15-20 с, при этом предметное стекло следует непрерывно покачивать. Очень важно четко придерживаться времени обесцвечивания, так как при его превышении обесцвечиваются и грамположительные бактерии.

6. Препарат промывают водой, накладывают на него полоску фильтровальной бумаги, пропитанной фуксином Пфейфера, смачивают ее водой и окрашивают в течение 1 мин.

7. Бумажку с красителем удаляют, препарат промывают водой, осушают фильтровальной бумагой.

8. На препарат наносят кедровое масло и рассматривают с иммерсионным объективом.

После такой обработки грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в красный.

Грамположительными являются микрококки, стрептококки, стафилококки, бациллы, клостридии, молочнокислые бактерии. К грамотрицательным относятся кишечные палочки, сальмонеллы, бруцеллы, возбудители дизентерии, холеры, уксуснокислые бактерии, псевдомонады и др.

7.3. Обнаружение подвижности бактерий

Многие виды бактерий способны к самостоятельному движению благодаря наличию у них жгутиков. Расположение жгутиков и их количество является одним из диагностических признаков при определении вида бактерий.

Для обнаружения подвижности бактерий готовят препараты «висячая капля» или «раздавленная капля», используя молодые (односуточные) бульонные культуры бактерий. При наблюдении под микроскопом в поле зрения хорошо видно активное перемещение отдельных клеток в разных направлениях и с разной скоростью.

7.4. Окрашивание спор бактерий

Благодаря особенностям своего строения споры бактерий обладают высокой устойчивостью к различным неблагоприятным факторам внешней среды. При обычной обработке препарата метиленовым синим споры не окрашиваются и выглядят как бесцветные круглые, овальные или эллипсовидные тельца, хорошо преломляющие свет. Это объясняется тем, что оболочка споры обладает большой плотностью, характеризуется высоким содержанием липидов и в самой споре отсутствует свободная вода. Методы окрашивания спор основаны на применении протравливающих веществ (обычно слабых кислот, разрыхляющих оболочку споры) и дальнейшей окраске мазка красителем при нагревании. Окрасившийся протопласт споры удерживает краситель прочнее, чем цитоплазма клетки, поэтому он, в отличие от цитоплазмы, не обесцвечивается при последующей обработке кислотой. Обесцвеченную цитоплазму дополнительно окрашивают контрастным красителем.

Метод Циля -Нильсена

1. Готовят обычным способом фиксированный препарат бактерий.

2. На препарат наносят 5 %-й раствор хромовой кислоты и выдерживают в течение 5-10 мин.

3. Кислоту смывают водой, на препарат наносят полоску фильтровальной бумаги и обильно смачивают ее карболовым фуксином. Подогревают препарат над пламенем спиртовки до появления паров (не доводя до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 5-7 мин. Важно, чтобы краситель не испарялся, и бумага не подсыхала.

4. После охлаждения предметного стекла бумагу снимают, препарат промывают водой и обрабатывают 1 %-м раствором соляной или серной кислоты в течение 15-30 с. При приготовлении препарата спорообразующих палочек В. subtilis, B. mycoides или B. mesentericus цитоплазму клеток рекомендуется обесцвечивать в течение 16-18 с.

5. Препарат окрашивают метиленовым синим в течение 1-2 мин, затем краситель смывают, препарат осушают фильтровальной бумагой и рассматривают с иммерсионным объективом.

При такой обработке препарата споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные клетки - в синий.

Метод Пешкова

1. На приготовленный фиксированный препарат наливают метиленовый синий Леффлера и, держа стекло над пламенем, кипятят в течение 15-20 с, не допуская высыхания краски.

2. Мазок промывают водой и докрашивают 0,5 %-м раствором нейтрального красного в течение 30 с.

3. Препарат промывают водой, осушают и рассматривают с иммерсионным объективом.

При этом методе окраски споры окрашиваются в голубой или синий цвет, а цитоплазма клеток - в розовый.

Для идентификации бактерий важно выяснить тип спорообразования (бациллярный, клостридиальный или плектридиальный), расположение эндоспоры в клетке (полярное, центральное, эксцентральное), форму свободных спор (округлые, овальные, цилиндрические). Для этой цели используют двух- или трехсуточные культуры спорообразующих бактерий.

7.5. Выявление капсул у бактерий

Некоторые микроорганизмы, особенно при росте на богатых углеводами средах, образуют капсулы. Наличие капсулы является диагностическим признаком при идентификации бактерий. При обычных методах окрашивания бактерий капсулы остаются бесцветными. Для выявления капсул применяют специальные методы окраски.

Окраска капсул по методу Гинса-Бурри. Жидкая черная тушь разводится дистиллированной водой в соотношении 1:10. Каплю суспензии бактерий смешивают на предметном стекле с каплей разведенной туши, тщательно размешивают и распределяют тонким слоем на поверхности стекла. Препарат высушивают на воздухе и рассматривают с иммерсионным объективом. На дымчато-темном фоне препарата бактериальные клетки окружены бесцветными капсулами.

Контрольные вопросы

1. Какие методы исследования морфологии бактерий Вам известны?

2. В чем заключается сущность и техника окраски бактерий по Граму?

3. Каковы особенности окрашивания спор бактерий?

4. Какими методами можно установить подвижность бактерий?

5. Каким методом пользуются для выявления капсул у бактерий?