ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

8. ИЗУЧЕНИЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ И ФИЗИОЛОГОБИОХИМИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ БАКТЕРИЙ

Цель работы: рассмотреть культуральные и физиологобиохимические признаки бактерий, выращенных на различных питательных средах.

8.1. Культуральные признаки бактерий

Культуральные признаки бактерий выявляют по особенностям их роста на различных жидких и плотных питательных средах. Каждый вид микробов образует на плотных средах колонии определенного размера, соответствующей формы.

Колонии характеризуют по размеру, форме, профилю, контуру края, поверхности, цвету, структуре и консистенции.

Размер колонии определяется ее диаметром, в зависимости от которого различают точечные колонии - диаметр менее 1 мм, мелкие - диаметр 1-2 мм, средние - от 2 до 9 мм, крупные - 10 мм и более.

Форма колонии бывает округлой, неправильной, амебовидной, розетковидной, концентрической и т. д. (рис. 8.1).

Рис. 8.1. Формы колоний микроорганизмов: а - круглая; б - круглая с фестончатым краем; в - круглая с валиком по краю; г, д - ризоидные; е - круглая с ризоидным краем; ж - амебовидная; з - мицелиальная; и - складчатая; к - неправильная; л - концентрическая; м - сложная

Профиль колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Определяется профиль колонии при визуальном изучении сверху и сбоку. Различают плоские, выпуклые, кратерообразные, конусовидные, каплевидные колонии (рис. 8.2).

Рис. 8.2. Профиль колоний микроорганизмов: а - изогнутый; б - кратеровидный; в - бугристый; г - врастающий в агар; д - плоский; е - выпуклый; ж - каплевидный; з - конусовидный

Край колонии определяют при рассмотрении его через лупу или в микроскоп с увеличением 8х. Различают следующие контуры края колоний: ровный, волнистый, бахромчатый, зубчатый, фестончатый, лопастной, реснитчатый, ворсинчатый, ветвистый, ризоидный и др.

Поверхность бывает гладкой или шероховатой, сухой или влажной, бороздчатой, складчатой, морщинистой, бархатистой, бугристой, с концентрическими кругами или радиально исчерченная.

Оптические свойства: прозрачная, полупрозрачная, непрозрачная, флуоресцирующая.

Цвет колонии определяется пигментом, который синтезируется данным видом микроорганизма. В зависимости от типа образуемого пигмента колонии микроорганизмов могут быть окрашены в красный, розовый, желтый, золотисто-оранжевый, желто-зеленый, синий, черный цвет.

Структура колонии бывает однородной, мелко- или крупнозернистой, мучнистой, пленчатой, врастающей в агар.

Консистенция может быть пастообразной, легко снимающейся петлей, вязкой или слизистой, прилипающей и тянущейся за петлей; плотной; волокнистой; тестообразной; сметанообразной; сухой, снимающейся с поверхности агара в виде упругой пленки; хрупкой, рассыпающейся при прикосновении петлей. Консистенцию колонии устанавливают, прикасаясь к ее поверхности петлей.

При посеве микроорганизмов штрихом отмечают интенсивность роста (обильный, умеренный, слабый), особенности штриха (затягивающий, ветвистый, бугристый), оптические свойства поверхности, цвет, консистенцию.

Для характеристики роста бактерий в жидких средах производят посевы культур в мясопептонный бульон или другую среду, обеспечивающую их хороший рост. Для описания роста используют 4-7-суточные культуры, выращенные в стационарных условиях. В первую очередь отмечают интенсивность роста (скудный, умеренный, обильный). Затем обращают внимание на помутнение среды (однородное, хлопьевидное, с шелковистой волнистостью), наличие пленки (толстая или тонкая, сухая или слизистая, гладкая или складчатая, кольцеобразная или сплошная). Если культура пигмента не образует, то цвет среды не изменяется, а осадок приобретает, как правило, серовато-белый или желтовато-коричневый цвет. Нередко рост микроорганизмов в жидкой среде сопровождается появлением запаха, выделением газа. Газообразование обнаруживается по появлению пузырьков или пены.

8.2. Физиолого-биохимические признаки бактерий

При изучении физиолого-биохимических признаков бактерий исследуют их отношение к кислороду, ферментативную активность, способность расщеплять различные углеводы с накоплением определенных продуктов метаболизма.

Отношение к кислороду воздуха. По отношению к кислороду воздуха микроорганизмы делят на облигатные аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Об отношении бактерий к кислороду судят по росту культуры при посеве ее уколом в столбик с питательным агаром. Аэробы развиваются в верхней части укола, анаэробы - в нижней части, а факультативные анаэробы - равномерно по всему уколу.

Среди биохимических свойств культуры наиболее важно определение их ферментативной активности.

Использование углеводов и спиртов культурами микроорганизмов определяют путем посева 0,1 — 0,2 см суспензии исследуемых клеток в пробирки с жидкой или полужидкой средой, содержащей углевод и индикатор. Для обнаружения образования газа при расщеплении углеводов в жидкую среду опускают поплавки. Набор сред с углеводами и индикатором называют «цветным» рядом Гисса. Название «цветной» ряд связано с тем, что под действием ферментов клеток одни сахара расщепляются с накоплением кислоты, или щелочи, за счет чего изменяется цвет индикатора и среды, другие сахара не расщепляются, и цвет среды не изменяется. Короткий ряд Гисса включает среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой и маннитом. В длинный ряд дополнительно вводят среды с арабинозой, ксилозой, рамнозой, галактозой, а также полисахариды (инулин, крахмал, декстрин) и спирты (глицерин, дульцит, инозит).

Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре. Результаты учитывают через 2 — 4 сут (для медленно растущих микроорганизмов — через 7 — 10 сут). Отмечают изменение цвета индикатора или отсутствие изменения цвета среды, а также появление или отсутствие газа в поплавке.

На основании полученных данных делают вывод, какие сахара ассимилирует исследуемая культура бактерий.

Протеолитическая активность. Микроорганизмы, обладающие протеолитической активностью, разжижают желатин, пептонизируют молоко. Для определения этого признака культуру исследуемых бактерий засевают уколом в пробирки с желатином и культивируют в течение 4-10 сут при комнатной температуре, отмечая при этом скорость разжижения и его характер: послойный, воронкообразный, пузырчатый и т. п. (рис. 8.3).

Рис. 8.3. Характер разжижения желатина протеазами исследуемых бактерий

Каталазная активность. Фермент каталазу образуют многие аэробные микроорганизмы. Для проведения исследования каплю 10 %-го раствора пероксида водорода наносят на колонию микроорганизма, выросшую в течение 24 ч на плотной среде в чашке Петри. Выделение кислорода в виде пузырьков газа свидетельствует о наличии в клетках бактерий каталазы.

Характер роста в молоке. Обезжиренное молоко разводят водой в соотношении 4:1, добавляют индикатор бромкрезоловый пурпурный (2 см3 1,6 %-го спиртового раствора на 1 дм3 молока) или лакмус (10 см3 4 %-го раствора на 1 дм3 молока), разливают в пробирки емкостью 8-10 см и стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа в течение 20 мин. Пробирки с молоком засевают исследуемой культурой бактерий и культивируют 6-14 сут. при оптимальной температуре. Образование кислот микроорганизмами при расщеплении лактозы отмечают по изменению цвета индикатора. Если кислота накапливается в значительном количестве, то образуется сгусток. Бактерии, обладающие активными протеазами, расщепляют казеин, вызывая пептонизацию молока.

Образование индола. Некоторые микроорганизмы обладают способностью расщеплять аминокислоту триптофан с образованием индола, что также является диагностическим признаком при определении вида бактерий. Для определения индола применяют метод Мореля. Пробирки с 8-10 см стерильного мясопептонного бульона с добавлением 0,01 %-го триптофана (или без него) засевают исследуемой культурой бактерий. Под ватной пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную щавелевой кислотой. Пробирки инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. При образовании индола нижняя часть полоски окрашивается в розовый цвет.

Образование аммиака. Аммонификация белковых веществ под влиянием ферментов микроорганизмов сопровождается выделением аммиака. Эту способность бактерий устанавливают путем засева исследуемой культуры в пробирки с мясопептонным бульоном, которые инкубируют в течение 2-3 сут. в термостате при температуре 37 °С. Образование аммиака определяют по изменению окраски полоски лакмусовой бумажки, укрепленной между пробкой и горлышком пробирки таким способом, чтобы полоска не касалась питательной среды. Выделение аммиака обозначается изменением цвета лакмусовой бумажки из красного в синий.

Образование сероводорода. При расщеплении микроорганизмами серосодержащих аминокислот (цистеин, метионин) образуется сероводород. Для определения образования сероводорода пробирки с мясопептонным бульоном засевают исследуемой культурой бактерий и под пробкой укрепляют полоску фильтровальной бумаги, пропитанную раствором ацетата свинца. Засеянные пробирки помещают в термостат при оптимальной температуре на 7-10 сут. Выделение сероводорода фиксируют по почернению полоски вследствие образования сернистого свинца.

На основании морфологических, культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной культуры определяют ее видовую принадлежность, пользуясь определителем бактерий Берджи.

Исследования по идентификации бактерий оформляют в форме протокола (табл. 8.1).

В необходимых случаях проводят изучение других признаков, например, способность к восстановлению нитратов, образование оксидазы и т. д.

Таблица 8.1. Характеристика культуры по морфологическим, культуральным и физиолого-биохимическим признакам

Тест или признак

Результат

Морфологические признаки

Форма и расположение клеток

Окрашивание по Граму

Образование эндоспор

Образование капсул

Подвижность

Культуральные признаки

Морфология колоний

Характер роста в МПБ

Характер роста в молоке

Физиолого-биохимические признаки

Отношение к кислороду воздуха

Наличие каталазы

Протеолитическая активность

Образование сероводорода

Образование аммиака

Образование индола

Рост на среде Гиса, содержащей: глюкозу лактозу сахарозу мальтозу маннит

Контрольные вопросы

1. Какие признаки используются при определении вида бактерий?

2. По каким признакам характеризуют колонии бактерий на плотной питательной среде?

3. Как характеризуется рост бактерий в жидкой среде?

4. Как выявляется протеолитическая активность бактерий?

5. Как определить способность бактерий сбраживать сахара?

6. Какие изменения могут наблюдаться при развитии бактерий в молоке и как их объяснить?

7. Какие признаки свидетельствуют об образовании бактериями аммиака, сероводорода, индола?