Фізіологія рослин - Мусієнко М.М. 2001

Фізіологія рослин та біотехнологія. Досягнення і перспективи розвитку
Трансгенні культурні рослини

Перші трансгенні рослини було створено в 1980-1990 рр. і відтоді їх отримано для багатьох видів рослин, які мають практичну цінність. Це дозволило вченим проникнути в глибинитаємниць фундаментальних механізмів фізіології розвитку рослин. В цих дослідженнях було опробовано вже на вищих рослинах специфічну здатність Agrobacterium tumefaciens переносити частину своєї ДНК в рослинні клітини. Вперше введення чужорідного гена в рослинну клітину за допомогою агробактерій, було здійснено на початку 80-х років в Інституті рослинництва ім. Макса Планка (Німеччина). Як результат, дослідні рослинні клітини набули стійкості до антибіотика канаміцину, який інгібує неоміЦинфосфотрансферазу II і гальмує ріст. Це було доказом можливості експресії чужорідних генів у рослині. До того ж стійкість до канаміцину може виступати в ролі маркера, бо досить незначна частина клітин може включати в свій геном введену ДНК, тому маркерні гени дозволяють ідентифікувати такі клітини.

Завдяки тотипотентності рослинних клітин з таких трансформованих клітин можуть регенерувати повноцінні, здатні до розмноження рослини. Для генетичної трансформації використовують різні типи експлантантів, наприклад висічки листків (leaf discs), сегменти стебла. В даний час цей спосіб перенесення генетичного матеріалу став стандартним в лабораторіях всього світу. Однак, незважаючи на простоту методу, багато видів рослин, серед яких найпоширеніші зернові культури (кукурудза, рис, пшениця), не є природними господарями агробактерій, тому трансформація їх цим шляхом досить проблематична.

Тому було розпочато пошук альтернативних шляхів і одним з перших кроків до вирішення даної проблеми було введення вільних ДНК в протопласти — рослинні клітини без клітинних стінок. Справа в тому, що пори клітинних стінок досить малі, щоб через них проникли молекули ДНК, тоді як в протопластах єдиним бар’єром для доставки ДНК виступає плазмалема. Найчастіше для доставки ДНК використовують поліетиленгліколь (ПЕГ) — органічний полімер, що проникає крізь плазматичну мембрану, або перенесення здійснюють шляхом дії коротких високовольтних імпульсів, які ненадовго відкривають пори, крізь які і проходить ДНК^Звідси і назва методу — електропорація. Однак знову ж таки регенерація рослин із ізольованих протопластів у багатьох видів відбувається із значними труднощами; це характерно для пшениці і кукурудзи.

З метою підвищення ефективності доставки генів у цілісні клітини Дж. Санфорд (1987) запропонував метод бомбардування генетичним матеріалом значної кількості рослинних клітин. Для цього металеві частинки (1-2 мкм) з вольфраму або золота вкривають ДНК і обстрілюють ними інтактні клітини із сконструйованої установки, яку вони назвали ДНК-пушкою (short gum) (рис. 215).

Рис. 215. ДНК-пушка для обстрілу клітин рослин гранулами з вольфраму, вкритими ДНК

Невеликі отвори, що виникають при цьому в мембранах та клітинних стінках, швидко затягуються. Такі установки успішно застосовують для одержання трансгенних рослин, в тому числі для трансформації кукурудзи та пшениці. Таким чином, ці два основних методи створення трансгенних рослин широко використовують в генетичній інженерії (рис. 216).

В обох випадках внесена ДНК вмонтовується в хромосоми, а потім клітина ділиться та регенерує цілу рослину (Гассер, Фрейли, 1992). Із інших способів генетичної трансформації варто згадати такі, як мікроін’єкції ДНК в рослинну клітину, обробка протопластів ультразвуком або пучком ультрафіолетового лазера.

Однак введення ДНК в клітину лише перший крок в процесі трансформації рослин. Потім настає кропітка робота створення рослин із заданими властивостями, але тут справа дещо полегшується завдяки тому, що гени за своєю природою керовані. Адже гени, що кодують білки, мають загальну принципову структуру, що складається з трьох ділянок: промотор — послідовність нуклеотидів, з допомогою яких визначається час і місце експресії даного гена; кодуюча ділянка, тобто та що містить інформацію про структуру білка — продукту даного гена; нарешті третя так звана область poly-А (ланцюг з аденілових нуклеотидів), що відповідає за своєчасне закінчення транскрипції — синтезу інформаційної, або матричної РНК, комплементарної кодуючої послідовності.

Рис. 216. Два основних методи створення трансгенних рослин: 1 — внесення ДНК в бактерію клітини Agrobacterium; 2 — внесення ДНК на мікроскопічні металічні частинки для ДНК-пушки; 3 — ДНК; 4 — металічні частинки; 5 — плазміда, яка індукує пухлини; 6 — хромосома; 7 — перенесення ДНК; 8 — ядро; 9 — хромосома: 10 — поділ клітин

Ці три ділянки методами генетичної інженерії можна комбінувати, збирати ці складові частини від різних генів, створювати так звані химерні гени (рис. 217) в будь-якого окремо взятого організму.

Використанням відповідних промоторів можна домогтися експресії даного гена навіть у бажаному конкретному органі — листку, корені, бульбі, зернівці, і навіть у певних типах клітин цих органів.

Перенесення генів обіцяє бути надзвичайно перспективним, зокрема в клітинній селекції. Одержано перші результати щодо створення організмів, стійких до вірусних захворювань. Генетичні методи створення таких рослин базуються на основі глибокого розуміння фізіології хворої рослини. Цим шляхом багато сільськогосподарських культур набули здатності ефективно протистояти більше ніж десяти різним вірусам.

Рис. 217. Химерний ген стійкості до канаміцину, який зібраний із різних джерел: промотор — з вірусу рослин, кодуюча ділянка з бактерії Escherichia coll ділянка poly-а з транслокованої ДНК (тДНК) Agrobacterium

Проводяться також роботи щодо створення у рослин стійкості до шкідливих комах. В середині 80-х років в США змогли виділити бактеріальні гени, які кодують білки-інсектициди. Щодо відношення до бавовника ці методи дозволяють уже в найближчій перспективі скоротити застосування інсектицидів на 40-60%. Одержано модифікований ген, який забезпечує стійкість рослин до колорадського жука. Польові дослідження, проведені в багатьох районах США в 1991 р. з рослинами, в яких було експресовано такий «інсектицидний» ген, довели, що такі рослини винятково стійкі до ушкоджень колорадським жуком.

Також ідентифіковані гени проти нематод, комарів. На відміну від тимчасово діючих пестицидів такі білки не вимиваються, вони розпадаються аналогічно іншим білкам, нетоксичні, тому це найбільш екологічно чисті пестициди. В цьому напрямку перспективні і роботи щодо створення трансгенних рослин, стійких до бур’янів, як альтернатива гербіцидам та для вирішення цілого ряду інших проблем.

Так, останнім часом ідентифіковано і виділено ряд генів, що забезпечують синтез етилену, який ініціює дозрівання плодів. Можна також поліпшити якість цілого ряду продуктів харчування, примусити рослинний організм синтезувати специфічні сполуки — крохмаль, технічні масла, ферменти, біологічно активні речовини.

Початок 90-х років у різних країнах світу ознаменувався розгортанням польових досліджень з генетично модифікованими рослинами. Це —яблуня, малина, горіх, пшениця, соя, горох, цукровий буряк, кукурудза, рис, жито, картопля, помідори, виноград і багато інших. Якщо в 1996 р. площі, на яких вирощували трансгенні рослини складали 3 млн.га, то в 1997 р. — 12 млн.га, в 1998 р. — 26 млн.га, а в 1999 р. — майже 40 мільйонів гектарів (Джеймс, 2000). В Україні такі роботи розпочали академіки К.М. Ситник, Ю.Ю Глеба і в даний час проводять в різних науково-дослідних установах НАН України та в галузевих інститутах.

Одна з головних проблем, з якими зіткнулась генетична інженерія на початку нового тисячоліття — це насторожене сприйняття громадськістю, особливо деяких розвинених країн Європи, факту появи на полях в різних країнах світу генетично модифікованих рослин та

вживання, виготовлених з них продуктів харчування. При визначенні ступеня ризику при використанні трансгенних рослин думки вчених розділилися. Одні вважають, що трансгенні рослини, як і продукти виготовлені з них, безпечні і потрібно ввести лише мінімальний контроль за ними. Прихильники такого погляду вважають, що немає принципових відмінностей між генетичною інженерією і традиційною селекцією, яку здійснює людина. Різниця лише у швидкості процесу досягнення кінцевої мети. На користь доказу безпеки свідчить той факт, що з 1985 р. у світі проведено понад 25000 польових випробувань принаймі 60 різних видів генетично трансформованих рослин у 45 країнах і ніяких несприятливих наслідків не спостерігали.

Згідно іншої точки зору, з введенням трансгенних рослин в природне середовище, зростає потенційна небезпека порушення екологічної рівноваги, непередбачуваного перенесення введених генів іншим організмам, зменшення різноманіття сільськогосподарських культур.

Нарешті, є ще одна — крайня точка зору, згідно якої даний напрямок біотехнології має бути забороненим, так як знання про неї ще недостатні, щоб гарантувати повну безпеку.

Більшість вчених єдині у думці, що дослідження з трансгенними організмами потребують ретельного контролю, проте немає підстав вважати, що результати їх можуть бути катастрофічними. Існує необхідність в узгоджених на міжнародному рівні принципів, відповідно до яких буде оцінюватися ризик та здійснюватиметься управління всіма аспектами нових біотехнологій. Необхідно прийняти відповідні закони та впровадити засоби контролю щодо ризику, який виникає при появі генетично трансформованих організмів.