Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики)
Інші методи ДНК-діагностики - Блот-гібридизація за Саузерном

Метод було запропоновано в 1975 р. англійським дослідником Саузерном. При обробці тотальної геномної ДНК людини рестриктазами утворюється дуже велика кількість фрагментів різної довжини. При електрофорезі не вдається ідентифікувати окремі фрагменти ДНК. Після електрофорезу рестриктованої геномної ДНК утворюється рівномірне забарвлення по всій довжині гелю — так званий шмер. Ідентифікація потрібних фрагментів ДНК у такому гелі можлива тільки шляхом гібридизації з міченими ДНК-зондами. Це досягається за допомогою методу блот-гібридизації за Саузерном (саузерн-блотинг).

Методика його складається з таких етапів:

1) виділення та очищення ДНК. Необхідне хороше очищення ДНК. Для виділення ДНК одержаний біологічний матеріал обробляють протеолітичними ферментами, щоб видалити всі білки. ДНК адсорбують на пористих носіях або екстрагують органічними розчинниками, після чого здійснюють багатократне очищення. При цьому одержують всю ДНК клітин (геномну ДНК);

2) обробка ДНК рестриктазами. Геномну ДНК обробляють однією з рестрикційних ендонуклеаз. Після цього проводять електрофорез рестрикційних фрагментів ДНК в агарозному гелі. Але ідентифікація фрагментів безпосередньо в гелі в даному випадку утруднена, оскільки в гелі одержують суцільну послідовність фрагментів різної довжини;

3) блотинг. Наступний етап методу — блотинг — перенесення фрагментів з гелю на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр (рис. 10.11). Попередньо гель обробляють лугами, що призводить до денатурації ДНК (розриваються водневі зв’язки між комплементарними нуклеотидами у двох ланцюгах ДНК). Потім гель вміщують у буферний розчин, зверху на нього кладуть нітроцелюлозний фільтр, потім вміщують пачку фільтрувального паперу. Папір вбирає сольовий розчин. Він підіймається вгору і вимиває денатуровані фрагменти ДНК на фільтр, який має таку величину пор, що не пропускає ДНК. На фільтрі одержують точну копію розташування рестрикційних фрагментів у гелі;

4) гібридизація з ДНК-зондами. Фіксовану на фільтрі ДНК гібридизують з ДНК-зондами. Зонд — однониткова ДНК, комплементарна певній послідовності гена, що вивчається. Як зонди часто використовують штучно синтезовані олігонуклеотидні послідовності ДНК розміром не більше 30 нуклеотидів, здебільшого фрагменти некодуючих послідовностей, що часто зустрічаються. Можуть використовуватися зонди, мічені радіоактивно або хімічними речовинами, наприклад, флуоресцентними барвниками. Радіоактивно мічені зонди, синтезовані з нуклеотидів, що містять радіоактивний ізотоп ³²Р, забезпечують дуже високу чутливість, але недовговічні та небезпечні. Нині пріоритет віддається зондам, міченим хімічними речовинами;

5) аналіз одержаних результатів. Фільтр відмивають від надлишку зонда. Якщо використовують радіоактивно мічені зонди, на нього накладають рентгенівську плівку. У тому місці, де відбулася гібридизація зонда з ДНК, відбувається засвічення плівки. Положення шуканого фрагмента ДНК можна визначити за допомогою методу авторадіографії (рис. 10.12).

Якщо використовують хімічні мітки, то результати гібридизації можна зареєструвати візуально при освітленні видимим або ультрафіолетовим світлом (залежно від виду використовуваного барвника).

Таким чином, блот-гібридизація дозволяє ідентифікувати специфічні послідовності нуклеотидів у загальному наборі рестрикційних фрагментів геномної ДНК. Коли та чи інша мутація торкається сайта пізнавання використовуваної при блот-гібридизації рестриктази, на плівці можна чітко зафіксувати відсутність відповідної смуги або появу атипового фрагмента ДНК. Подовження або укорочення фрагмента ДНК спричинює появу смуги в атиповому місці.

Class="center">

Рис. 10.11. Перенесення ДНК з агарозного гелю на мембранний фільтр за методом Саузерна

Існує кілька модифікацій саузерн-блотингу без попередньої рестрикції і електрофорезу. На фільтр наносять геномну ДНК і гібридизують із зондами.

Метод блот-гібридизації має високу чутливість, проте він вельми трудомісткий, ставить високі вимоги до очищення ДНК, необхідна велика кількість геномної ДНК. Якщо використовуються радіоактивні зонди, то необхідні спеціально обладнані лабораторії. Тривалість і трудомісткість усієї процедури роблять цей метод високовартісним.

Сьогодні в більшості лабораторій використовують дешевший і не менш точний метод полімеразної ланцюгової реакції.

Проте блот-гібридизація за Саузерном і сьогодні використовується для діагностики моногенних захворювань — коли через якісь причини метод ПЛР неможливо застосувати. Так, для здійснення ПЛР необхідно точно знати структуру кодуючих ділянок гена та інтронних ділянок, які примикають до них (без чого неможливо синтезувати праймери, що ініціюють реакцію). Деякі ділянки гена, що містять наддовгі тандемні тринуклеотидні повтори або більш складні повтори, не можуть бути ефективно ампліфіковані. Крім того, виникають складнощі в ампліфікації великих і складних за своєю організацією генів (таких, як ген дистрофіну), виявленні протяжних делецій у гетерозиготному стані та деяких інших випадках.