Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики)
Модифікація ПЛР

Існує велика кількість модифікацій методу ПЛР, розроблених для швидкого сканування геному і пошуку відомих генних мутацій.

Мультиплексна (мультипраймерна) ПЛР грунтується на одночасній ампліфікації в одній реакції кількох екзонів досліджуваного гена або кількох фрагментів різних генів (див. рис. 10.8), що дозволяє проводити експрес-скринінг найчастіших мутацій у гені або виявляти водночас Мутації в різних генах.

Алель-специфічна ампліфікація грунтується на використанні різних пар праймерів, один з яких є комплементарним нормальній, а другий — мутантній послідовності ДНК. В результаті такої реакції в розчині синтезуються два різновиди ПЛР-продуктів — нормальні та мутантні, що розрізняються за своєю будовою.

Метод сайт-спрямованої модифікації ампліфікованої ДНК грунтується на використанні в ПЛР специфічного mismatch-праймера, відмінного від матричної послідовності на один нуклеотид. У результаті включення такого праймера до складу мутантного ПЛР-продукту в ньому утворюється штучно створений сайт рестрикції для однієї з рестриктаз, що дозволяє провести ДНК-діагностику за допомогою рестрикційного аналізу.

Існують спеціальні способи проведення ПЛР, які дозволяють вивчати не тільки ДНК, але і РНК. Це важливо, наприклад, при дослідженні РНК-вмісних вірусів (ретровіруси, зокрема ВІЛ, вірус гепатиту С, грипу А та ін.), а також при аналізі експресії різних генів в організмі. Подібні Методики зазвичай включають два етапи: зворотну транскрипцію та ПЛР на матриці одержаної ДНК.

ПЛР у реальному часі. Одним із перспективних напрямів ДНК-технологій, що швидко розвиваються, є ПЛР у реальному часі (Real-time PCR). Цей метод не потребує електрофорезу продуктів ампліфікації в агарозному або поліакриламідному гелі. Виявлення наявності або відсутності продуктів ампліфікації може здійснюватися двома шляхами: реєстрацією флуоресценції продуктів ампліфікації або за характером температурних кривих етапу відпалу, які залежать від наявності або відсутності шуканої ДНК-мішені.

Застосування ПЛР у реальному часі дозволяє значно заощадити час і скористатися перевагами «закритої системи», оскільки не потрібно відкривати пробірки з реакційною сумішшю. Таким чином запобігають можливості контамінації продуктів ампліфікації та виникнення хибнопозитив- них результатів. Метод Real-time PCR особливо перспективний при діагностиці вірусних і бактеріальних інфекцій.