БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009

РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ

Вектори

Вектори — молекули ДНК, що використовуються для перенесення генів від організму-донора до організму-реципієнта, а також для клонування нуклеотидних послідовностей.

Ідеальна векторна молекула повинна володіти такими властивостями:

- тривалий час існувати в популяції клітин-реципіентів;

- мати біохімічні або генетичні маркери, що дозволили б виявити наявність вектора у клітинах;

- структура векторної молекули повинна допускати вбудовування в неї чужорідної послідовності нуклеотидів без порушення її функціональної цілісності.

Як вектори використовують плазміди, косміди, Хромосоми вірусів, штучні хромосоми бактерій, бактеріофагів, дріжджів, ссавців (табл. 1.1).

Class="center">Таблиця 1.1

Порівняльна характеристика різних векторів для Клонування ДНК

Плазмідні вектори найчастіше використовуються в генній інженерії. Плазміди - це позахромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК, що автономно реплікуються. У клітині плазміди працюють як ген, здійснюючи синтез нових білків.

Першу плазміду відкрили Дж.Дж. Келлі, Г.О. Сміт та К. Уілкокс у 1968 р. Американський біохімік Стенлі Коен висловив припущення про те, що плазміди можна використовувати для перенесення генів. Проведено експерименти з ллазмідами різних видів бактерій. Учені створили рекомбінантні плазміди з фрагментів плазмід золотистого стафілокока Staphylococcus aureus (стійкість до пеніциліну) і кишкової палички Е.соlі (стійкість до тетрацикліну). Гібридні плазміди ввели в клітини Е.соlі, отриманий штам був стійким до пеніциліну і тетрацікліну. Цей експеримент довів, що можна здійснювати перенесення генетичної інформації між різними видами організмів.

Плазміди є практично у всіх бактерій. Головна хромосома бактерій містить 1000-5000 генів. Плазміди містять менш ніж 5% генетичної інформації (50 250 генів). Одні з них містять гени, що забезпечують їх перенесення з однієї клітини в іншу (F-плазміди), інші містять гени стійкості до антибіотиків (R-плазміди) або гени, що забезпечують утилізацію ксенобіотиків (плазміди деградації). Розмір плазмід може бути менше 1 і більше 500 тис. п. н.

Деякі плазміди представлені в клітинах 10-100 копіями, які називаються висококопійними. Низькокопійні плазміди містяться у клітинах у кількості І - 4 копії. Частка плазмідної ДНК становить 0,1-5% від загального вмісту ДНК у клітині.

Плазміди серії pBR використовуються як основа для конструювання плазмідних векторів. Ці плазміди створені на основі природної плазміди, що дає клітинам Е.соlі стійкість до коліцину. Недоліком плазмідних векторів є їх мала ємність.

Вектори на основі хромосоми бактеріофага λ використовують, якщо необхідно вбудувати великий фрагмент ДНК. Молекула ДНК бактеріофага λ має довжину близько 45 тис. п. н., усередині молекули розміщується ділянка довжиною 15 тис. и. н., яку можна замінити на будь-який фрагмент ДНК. У вектори на основі хромосоми бактеріофага λ можна вбудовувати фрагменти ДНК довжиною 15-25 тис. п. н.

Вірусні вектори застосовуються в експериментальній генній терапії під час Лікування людей. Недоліком векторів на основі хромосоми бактеріофага λ є те, що генетичний матеріал вбудовується в будь-які ділянки молекули ДНК, процес перенесення генів важко контролювати.

Косміди - це невеликі плазміди, в які in vitro введені cos-сайти ДНК бактеріофага λ. Cos-сайти розміщуються на відстані 35—45 тис. п. н, один від одного, між cos-сайтами міститься весь Геном фага, він може бути замінений на аналогічний за довжиною фрагмент чужорідної ДНК. Косміди можуть включати до 40 тис. п. н. чужорідної ДНК і при цьому активно ампліфжуватися в клітинах Е.соlі.

Фазміди — це векторні молекули ДНК, що містять генетичні елементи плазмід і хромосом бактеріофагів.

Штучні хромосоми - це дволанцюгові молекули ДНК з теломсрами на кінцях, центромерою і сайтами зв’язування для ДНК-полімерази. З метою Введення великих фрагментів ДНК у диференційовані та ембріональні клітини створено штучні хромосоми бактерій (ВАС - bacterial artificial chromosome), бактеріофагів (РАС - PI phage-derived artificial chromosome), дріжджів (YAC - Yeast artificial chromosome), ссавців (MAC - mammalian artificial chromosome) і людини (НАС-human artificial chromosome).

Найчастіше застосовують бактеріальні штучні хромосоми, створені у 1992 р. Основою їх є F-плазміда Е.соlі, бактеріальні теломери та центромєра. Ці структури дозволяють уводити в клітину великий фрагмент ДНК довжиною до 300 тис. п. н. Бактеріальні штучні хромосоми достатньо стабільні в бактеріальному геномі, під час росту і розмноження бактерій штучні хромосоми рєплікуються.

Над створенням перших штучних хромосом на основі дріжджів працювали А. Мюрей і Дж. Шостак (1983) та Д. Берк (1987). Такі штучні хромосоми можуть включати ще більший обсяг генетичного матеріалу — фрагмент ДНК довжиною до 1 млн п. н. Недоліком їх є менша стабільність порівняно з бактеріальними штучними хромосомами.

Штучні хромосоми тварин і людини дають змогу вводити в них цілі генетичні локуси й одержувати експресію відповідних генів у культурі клітин чи трансгенних тваринах. Перші штучні Хромосоми людини створено у 1997 р. Штучні хромосоми не вбудовуються в геном клітини. Усередині клітини вони функціонують як автономні мініхромосоми, здійснюючи експресію генів. Штучні хромосоми вводять у клітини шляхом електропорації. Під дією електричних імпульсів у клітинній мембрані утворюються пори, через які штучні хромосоми проникають усередину клітини.