Медична генетика - В. М. Запорожан 2005

Методи діагностики спадкових хвороб
Молекулярно-генетичні методи (методи ДНК-діагностики)
Використання молекулярно-генетичних методів у судовій медицині для ідентицікації особи і встановлення споріднення

Останніми роками для встановлення батьківства і проведення судово-медичних експертиз все частіше почали застосовувати Методи, засновані на виявленні індивідуальних генетичних відмінностей ДНК.

Такі відмінності можна знайти, досліджуючи високополіморфні (високоваріабельні або гіперваріабельні) ділянки ДНК, наприклад, ділянки з варіюючою кількістю тандемних повторів (variable number of tandem repeats, VNTR) — мінісателітні ДНК або короткі тандемні повтори (short tandem repeats, STR) — мікросателітні ДНК.

Ділянки з варіюючою кількістю повторів можуть розташовуватися в одній хромосомі в одному локусі або в кількох локусах у різних хромосомах.

Якщо аналізуються VNTR або STR, локалізовані в багатьох локусах, то вивчають Геном людини в цілому. Така Методика називається геномною дактилоскопією. Вперше геномну дактилоскопію провів англійський генетик Джеффриз (1985). Для ідентифікації особи він використав мінісателітну ДНК, повторювана одиниця якої була комплементарна інтрону гена міоглобіну. Вчений аналізував поліморфізм довжин рестрикційних фрагментів (ПДРФ) за допомогою методу блот-гібридизації за Саузерном з радіоактивно міченими зондами до інтрону міоглобіну.

Сьогодні варіабельні ділянки багатократно редуплікують за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції і аналізують після електрофорезу в гелі поліморфізм довжин ампліфікованих фрагментів ДНК (ПДАФ). При цьому в гелі одержують унікальну для кожної людини картину довжин фрагментів ДНК, яка дістала назву «геномного відбитку пальців» (фінгерпринт). Недоліком методу є отримання одномоментно великої кількості фрагментів, що утруднює аналіз результатів.

Сучасні Методики грунтуються переважно на аналізі VNTR, локалізованих в одному локусі. Прикладом може бути локус D1S80, локалізований в першій хромосомі. Локус містить мінісателітну ДНК. Довжина повтору 16 п. н., але кількість повторів може бути різною. Таким чином, у однієї і тієї ж людини в одній хромосомі локус має одну довжину, а в іншій — іншу. Наприклад, на рис. 10.13 зображена гіпотетична хромосома номер 1, що містить 3 повтори, і друга гомологічна з 7 повторами. Ці ділянки хромосом успадковуються за законами Менделя як кодомінантні ознаки. Дитина успадковує одну хромосому від матері (з певною кількістю повторів і відповідною довжиною локусу) і другу від батька (також із специфічною кількістю і довжиною). На порівнянні довжин фрагментів ДНК дитини, матері і передбачуваного батька грунтується встановлення батьківства. Ідентифікація особи можлива через унікальність картини довжин фрагментів ДНК у кожної людини.

Для аналізу варіабельних ділянок ДНК також використовують полімеразну ланцюгову реакцію. В реакційну суміш для ПЛР додають праймери до аналізованого локусу (наприклад, до локусу D1S80). Після електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі аналізують поліморфізм довжин ампліфікованих фрагментів (ПДАФ). При ампліфікації локусу D1S80 розмір ампліфікованих фрагментів варіює від 375 до 850 п. н.

На рис. 10.14 подано приклад встановлення і виключення батьківства за допомогою методу ПДАФ (за локусом D1S80). У випадку підтвердженого батьківства видно, що у матері наявні алелі 6 і 9 (вони відрізняються за кількістю повторів і довжиною), у батька — алелі 3 і 9. У дитини виявлено ті ж алелі, що й у матері (6 і 9). Оскільки дитина могла успадкувати алелі 6 і 9 від своєї матері, у біологічного батька один з цих алелів має бути відсутнім. У передбачуваного батька алель 6 дійсно відсутній, отже, він може бути батьком дитини. У суміші ДНК дитини і батька видно, що алель 9 у них співпадає.

У випадку непідтвердженого батьківства мати гомозиготна за алелем 11, у дитини знайдено алелі 11 і 3, у передбачуваного батька — алелі 13 і 9. Алель 11 дитина одержала від матері, отже, від біологічного батька вона повинна була одержати алель 3. Але у передбачуваного батька цей алель відсутній, отже, батьківство повинне бути виключене.

Рис. 10.13. Гіпотетична хромосома 1, що містить 7 повторів (верхня) і 3 повтори (нижня)

У більшості випадків для отримання достовірних результатів при встановленні батьківства з використанням методу ПЛР-ПДАФ аналізують чотири або п’ять незалежно успадкованих локусів.

Нині для ідентифікації осіб і встановлення батьківства частіше використовують мікросателітні ДНК, тобто визначають поліморфізм довжин STR. Аналізується генотип індивідуума одночасно за кількома STR-сайтами, локалізованими в різних хромосомах. З цією метою використовують мультиплексні варіанти ПЛР.

Для ідентифікації особи може бути використана Мітохондріальна ДНК. Для неї характерний материнський характер успадкування. Дослідження мітохондріальної ДНК здійснювалося при встановленні належності відомих єкатеринбурзьких останків до сім’ї Романових.

З часом буде можливе створення банку даних геномних дактилограм будь-якої людини (на зразок банку відбитків пальців).

Перевагами методу є:

1. Унікальність ДНК — кожна людина генетично індивідуальна (крім однояйцевих близнюків, які по суті є клонами).

2. Генетична постійність організму — генетична інформація не змінюється протягом життя і не залежить від типу клітин, з яких була виділена ДНК.

3. Чутливість методу — для сучасних ДНК-методів достатньо ДНК, виділеної з кількох клітин (теоретично — з однієї).

4. Відносна стабільність ДНК — молекулам ДНК притаманна підвищена стійкість до впливів навколишнього середовища. Ця властивість ДНК дозволяє проводити ідентифікацію навіть після дуже великого терміну давності, або ж якщо останки людини не можна розпізнати ніякими іншими методами.

Рис. 10.14. Приклад встановлення і виключення батьківства за допомогою методу ПДАФ за локусом D1S80 (МС — маркерна суміш алелів; М — мати; Д — дитина; ПБ — передбачуваний батько; ДПБ — суміш ДНК дитини і передбачуваного батька)