БИОЛОГИЯ Том 3 - руководство по общей биологии - 2004

25. ПРИКЛАДНАЯ ГЕНЕТИКА

25.7. Генетика человека

25.7.12. Генетическая дактилоскопия и генотипирование

Метод генетической дактилоскопии был разработан Алеком Джеффризом (Alec Jeffreys) и его коллегами в 1984 г. в Лестерском университете. Более поздний и более чувствительный вариант этого метода известен как генотипирование. Метод получил известность среди населения благодаря его использованию в громких уголовных делах, таких как дело футболиста О. Дж. Симпсона в США в 1995 г.

В геноме человека содержится около 100 000 генов (по последним данным их существенно меньше). Гены кодируют Белки, однако около 95% ДНК является некодирующей. Функция такой ДНК пока неизвестна, но возможно, она участвует в формировании правильной структуры хромосом в клетке. Около 30—40% такой ДНК представлена короткими последовательностями оснований, которые многократно повторяются. Некоторые из повторяющихся последовательностей разбросаны по всей ДНК, однако есть и такие, которые объединены в группы (кластеры), или другими словами, расположены тандемно. Такие «тандемные повторы» называют сателлитной ДНК (впервые они были выделены в виде отдельной фракции ДНК после центрифугирования). Каждый кластер повторяющихся последовательностей принято называть сателлитом. Число повторов в сателлитах варьирует. В некоторых из них (их называют минисателлитами) последовательности повторяются лишь несколько раз. Между отдельными индивидуумами обнаруживается огромное разнообразие в числе повторов этих коротких последовательностей (они являются «гипервариабельными»). Поэтому минисателлиты иногда обозначают VNTR (variable number tandem repeats). Каждый индивидуум имеет в определенном локусе два аллельных минисателлита: один наследуется от матери и один от отца. Генетическая дактилоскопия представляет собой анализ длин минисателлитных последовательностей данного индивидуума.

Процедура

ДНК выделяют из клеток и обрабатывают рестриктазой. Для разделения полученных фрагментов используют Электрофорез в агарозном геле; при этом фрагменты выстраиваются по размерам, как уже объяснялось в разд. 25.1 и показано на рис. 25.4. Дальнейшая процедура описана в разд. 25.7.9 и иллюстрируется рис. 25.34. Для переноса ДНК на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр используют Саузерн-блоттинг. Затем проводят гибридизацию ДНК с радиоактивным ДНК-зондом, который представляет собой последовательность, комплементарную повторяющейся минисатедлитной последовательности и идентифицируют связавшиеся с зондом фрагменты с помощью радиоавтографии.

Class="center">

Рис. 25.34. Генетическая дактилоскопия.

Как уже отмечалось, минисателлитные последовательности разных индивидуумов имеют различную длину. Зонд связывается с минисателлитами, которые у разных индивидуумов обнаруживаются в разных полосах на фильтре, поскольку их длины различны. Для каждого индивидуума рисунок (распределение минисателлитов) является характерным и поэтому называется дактилоскопическим отпечатком (рис. 25.34). Если зонд распознает и связывается с несколькими типами минисателлитов по всему геному, его называют мультилокусным зондом, и на радиоавтографе он будет давать множество полос. Чем больше полос, тем более уникален рисунок. Вероятность случайного совпадения четырех полос у двух людей составляет примерно 1 на 250, тогда как для 20 полос она меньше — 1 на 10¹² (на Земле около 4,5 · 10⁹ человек).

Мультилохусные зонды дают наилучший результат при использовании чистой, беспримесной ДНК. Однако судебные медики редко работают на свежем материале хорошего качества. Как правило, образцы чем-то загрязнены, например почвой или бактериями. Часто требуется более «мощный» метод. Этого достигают с помощью однолокусного зонда. Такой зонд можно использовать при работе с небольшими участками ДНК (например, с частично разрушенной ДНК), а также с малым количеством материала. Зонд распознает лишь одиночную короткую повторяющуюся последовательность, которая уникальна для одного миниеателлита и поэтому обнаруживается только на определенной паре гомологичных хромосом. При рестрикции образуются два характерных фрагмента для каждого индивидуума, и, следовательно, на радиоавтографе появятся две полосы, одна материнского и одна отцовского происхождения (рис. 25.35). Если используют два однолокусных зонда, то появится четыре полосы; если три, то — шесть, и т. д. Если требуется очень высокая достоверность в определении различий между двумя индивидуумами, то нужно использовать большое количество зондов (см. ниже). Этот метод называют генотипированием, а получаемый при этом профиль используют в судебной экспертизе чаше всего.

Метод можно сделать еще более чувствительным, если увеличить количество ДНК с помощью полимеразной ценной реакции (ПЦР). Это означает, что профиль ДНК можно получить, используя минимальную по объему пробу ДНК (например, выбитый с помощью дырокола кусочек облизанной подозреваемым почтовой марки). Любой человек, оставивший частичку перхоти или чихнувший на месте преступления, может стать подозреваемым!

Рис. 25.35. Наследование минисателлитов и разнообразие получаемых при этом профилей ДНК. Популяция в целом характеризуется огромным разнообразием длин минисателлитов, поэтому вероятность того, что у двух индивидуумов будут одинаковые профили ДНК, очень мала (см. текст).

Приложения

Ту же роль, что в начале 1900-х годов сыграла дактилоскопия, совершившая революционный переворот в судопроизводстве, в наше время играет метод генетической дактилоскопии. ДНК обычно выделяют из небольшого количества биологического материала, найденного на месте преступления, например пятен крови, волос или слюны. В случаях изнасилования используют сперму (рис. 25.36). Метод для Structure/97.html">Определения отцовства стал рутинным. На рис. 25.37 приведен пример использования профилей ДНК при решении спорного вопроса об отцовстве.

Рис. 25.36. Генетическая дактилоскопия крови жертвы, спермы (образец) и крови подозреваемых.

Рис. 25.37. Профили ДНК людей, участвующих в споре об отцовстве (М — мать, Р— ребенок, О — отец).

25.8. Посмотрите на рис. 25.37. Кто из детей данной матери является сыном или дочерью предполагаемого отца?

Метод генетической дактилоскопии впервые был использован в судебной экспертизе в Великобритании в 1986 г. В 1983 г. в деревне недалеко от Лестера была найдена изнасилованная и убитая школьница; в 1986 г. был найден второй труп. Подозреваемый признался во втором преступлении, однако полиция предполагала, что он виновен и в преступлении 1983 г. Полиция попросила сотрудника Лестерского университета Джеффриза провести дактилоскопию ДНК из образцов спермы, взятых на местах двух преступлений и ДНК из пробы крови подозреваемого. Результаты анализа показали, что человек не был виновен ни в одном из преступлений! Исследовали всех местных мужчин (около 1500 человек), но снова не получили положительного ответа. В конце концов убийцу поймали в результате случайно подслушанного разговора в пивной. Дактилоскопический анализ ДНК подтвердил его виновность. Однако примерно в 30% случаев метод генетической дактилоскопии не дает соответствия тестируемой ДНК по профилю ДНК, обнаруживаемой на месте преступления.

Надежность и обоснованность

Под надежностью понимают возможность получения одного и того же результата при каждом повторном тестировании. Например, получат ли две разные лаборатории одинаковый результат при использовании одной и той же пробы? Для повышения надежности в Европе принимаются меры по стандартизации процедуры. Это важно при расследовании уголовных дел международного плана, таких как терроризм и наркобизнес.

Под обоснованностью подразумевают, что данный тест соответствует всем предъявленным требованиям. В судопроизводстве самое большое беспокойство вызывает тот факт, что два индивидуума могут иметь один и тот же профиль пли дактилоскопический отпечаток ДНК. Судебные разбирательства по этому поводу стали в ряде случаев главным содержанием последних известий. Джеффриз рассчитал, что два человека будут иметь одну и ту же полосу при использовании мультилокусного зонда примерно в одном случае из четырех. Следовательно, вероятность составляет один шанс из 4ⁿ, где n — число полос. Так, есть 1 шанс из 256, что у двух человек будут 4 одинаковых полосы, и менее чем 1 шанс из 10¹², что они имеют 20—30 одинаковых полос (число полос в обычном дактилоскопическом отпечатке ДНК). Однако следует иметь в виду, что судебные эксперты часто вынуждены работать с материалом плохого качества, с деградированной ДНК, что не позволяет получить определенный ответ. Другая сложность заключается в том, что вероятность совпадения рассчитывается только для популяции в целом. Среди родственников будет обнаруживаться большее сходство.

Гораздо труднее сделать статистические расчеты для однолокусных зондов, поскольку каждая из полос встречается в популяции с разной частотой. В среднем, при использовании одного такого зонда полосы будут совпадать максимум в 1 случае из 100, при использовании двух зондов — в 1 случае из 10 000, а при использовании трех зондов — в 1 случае из 1 000 000. Между этническими группами существуют вариации, поэтому для разных групп населения должны использоваться различные Базы данных.

Приведем несколько примеров использования ДНК-профилей:

1) для установления отцовства;

2) для подтверждения чистоты породы у животных;

3) для контроля генетического разнообразия при разведении редких видов животных;

4) в гражданских спорах о наследстве;

5) в судебной экспертизе для идентификации личности преступника.