Химия белка. Структура, свойства, методы исследования - Шендрик А.Н. 2022

Методы экспериментального исследования структуры белков
Методы определения молекулярной массы белков
Определение молекулярной массы методом гель-фильтрации

В основе метода Structure/97.html">Определения молекулярной массы белков с применением гель-фильтрации лежит следующий эмпирический факт. Установлено, что объемы элюирования различных белков с одинаковыми молекулярными массами на одной и той же колонке в идентичных условиях практически совпадают. Это позволяет определять молекулярную массу неизвестного белка, если Колонка с гелем предварительно проградуирована (прокалибрована). Калибровка состоит в определении объемов элюирования нескольких чистых белков с известной молекулярной массой. Полученные данные наносят на график в виде зависимости логарифма ММ от объема элюирования (V_e). Такие зависимости в пределах одного - полутора порядков по величине молекулярных масс имеют, как правило, линейный вид. В качестве примера, на рисунке выше приведен такой график для ряда белков.

Class="center">

Вместо объема элюирования иногда пользуются коэффициентом распределения (К_р), который рассчитывают по формуле:

K_p = (V_e - V_внеш) / V_внутр

и строят далее калибровочный график в координатах линейного уравнения:

K_p = B - Alg MM

Отклонения от линейности наблюдается для очень больших молекул, низкомолекулярных веществ и некоторых белков. Таких, например, как Коллаген и фибриноген.

Для глобулярных белков и многих углеводов описанный метод определения молекулярной массы дает надежные результаты (= 10%).

При фракционировании белков в тонком слое геля G-200 (на пластине) наблюдается линейная зависимость между относительной длиной пробега пятна с белком и логарифмом его молекулярной массы. Относительную длину пробега рассчитывают по отношению к длине пробега некоторого стандартного белка, например, гемоглобина.

Для получения достоверных результатов гель-фильтрацию рекомендуется проводить в присутствии денатурирующих агентов, в концентрированном растворе хлоргидрата гуанидина, например.