МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие - 2012

ГЛАВА 15. МИКРОБИОЛОГИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ

15.9. МИКРОБИОЛОГИЯ ПИВА

15.9.2. Микроорганизмы, вызывающие порчу пива

В пиве могут размножаться только определенные виды микроорганизмов, приспособившиеся к существованию в специфических условиях пивоваренного производства. Подавление развития многих микроорганизмов вызывают антисептические вещества хмеля, невысокое содержание питательных веществ, кислая реакция среды (pH 5,4—4,6), созревание пива при низких температурах и образование дрожжами этанола. Тем не менее, посторонние микроорганизмы, попав в производство, постепенно адаптируются к условиям среды и технологического процесса и настолько приспосабливаются, что борьба с ними представляет определенные трудности. Благодаря усовершенствованным методам микробиологических анализов в последние годы наряду с известными бактериями, контаминирующими сусло и пиво, выявлены новые виды возбудителей порчи пива: строго анаэробные штаммы бактерий родов Pectinatus и Megasphaera.

Источниками контаминации сусла и пива посторонними микроорганизмами являются сырье, семенные дрожжи, вода, воздух, оборудование, инвентарь, коммуникации, одежда и руки обслуживающего персонала.

В пивоваренном производстве порчу пива могут вызывать как грамположительные, так и грамотрицательные бактерии (табл. 16).

Таблица 16. Микроорганизмы, вызывающие порчу пива

Виды микроорганизмов

Пороки пива

Грамположительные бактерии

Молочнокислые бактерии рода Lactobacillus:

L. brevis, L. pasteurianus, L. lindneri, L. diastaticus, L. plantarum, L. buchneri, L. casei и др.

Молочнокислые бактерии рода Pediococcus:

Р. datnnosus, Р. acidilactici Р. dextrinicus, Р. pentosaceus Р. inopinatus, Tetragenes halophilus Молочнокислые бактерии родов Leuconostoc и Lactococcus:

Leuc. mesenteroides, Lc. lactis ssp. diacetylactis

Помутнение («шелковистая муть»), повышение кислотности за счет накопления молочной кислоты

Неприятный вкус, быстрое прокисание, вязкость, маслянистый запах диацетила, опалесцирующая муть, слабое молочное помутнение, мелкозернистый осадок

Запах диацетила, вязкость

Бактерии родов Micrococcus, Staphylococcus, Kocuria

(S. epidermidis, S. saprophyticus, K. cristina, K. varians)

Неспецифический вкус, фруктовый запах

Бактерии рода Bacillus

Bacillus coagulans

Подкисление пива, образование нитрозамина

Грамотрицательные бактерии

Уксуснокислые бактерии родов Acetobacter, Gluconoacetobacter

(A. pasteurianus, G. oxydans)

Кислый вкус, помутнение, появление пленки, образование слизи, возникновение посторонних привкусов и запахов

Сем. Enterobacteriaceae — роды Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Proteus, Serratia

Влияние на ход брожения, фенольный запах, изменение вкуса

Hafnia alvei (синоним Obesumbacterium proteus)

Помутнение сусла, загрязнение производственных дрожжей, образование «шелковистой мути» в пиве, запах сероводорода, пастернака, фруктов

Rahnella aquatilis

Неприятный фруктовый, молочный, сернистый вкус и запах

Zymomonas mobilis

Накопление в пиве сероводорода и ацетальдегида, появление привкуса гнилых яблок или фруктов

Pectinatus cerevisiifilus

Накопление в пиве уксусной и пропионовой кислот, ацетоина, сероводорода

Megasphaera cerevisiae

Образование в пиве масляной и капроновой кислот, помутнение

Дикие дрожжи:

Brettanomyces anomalis, Candida tropicalis, C. intermedia, C. sake, Dekkera bruxellensis, Debaryomyceshansenii, Hanseniaspora uvarum, Issatchenkia orientalis, Kluyveromyces marxianus,

Pichia anomala, Pichiafermentans Saccharomyces pasteurianus, S. bayanus, S. unisporus, S. diastaticus, Schizosaccharomyces pombe, Torulaspora delbrueckii, ces bailii, Z. bisporus

Появление посторонних запахов: фруктово-эфирного, лекарственного, неприятные горечь и вкус, сильное помутнение, пленка на поверхности пива, хлопьевидный или гранулированный осадок

Среди грамположительных наиболее распространенными возбудителями порчи пива являются молочнокислые бактерии (МКБ) родов Lactobacillus, Pediococcus, Lactococcus, Leuconostoc.

Лактобациллы — палочки разной длины, неподвижные, не образующие эндоспор и капсул. Вызывают как гомо-, так и гетероферментативное молочнокислое брожение. Чаще всего в пиве обнаруживаются виды L. brevis, L. casei.

Педиококки — гомоферментативные кокки, располагающиеся попарно или терадами. Они давно связаны с микробиологией пива, и первоначально их называли пивными сардинами. Педиококки размножаются при оптимальной температуре 21—25 °С, температурный диапазон их роста 7—45 °С. Чаще всего педиококки размножаются в пиве низового брожения и редко — в пиве верхового брожения. Из выявленных в пиве педиококков наиболее широко распространен и опасен Р. damnosus (синоним Р. cerevisiae). Этот микроб не встречается в сырье и обнаруживается лишь в пиве, пивных дрожжах и винах.

Лейконостоки — гетероферментативные кокки овальной формы, располагающиеся парами или короткими цепочками. Эти МКБ часто встречаются на овощах, фруктах, в бродящих растительных материалах. Единственным выявленным на пивоваренных заводах видом является Leu. mesenteroides.

Лактококки. Среди гомоферментативных кокков на пивоваренных предприятиях встречается иногда Lactococcus lactis ssp. diacetylactis, способный продуцировать диацетил из цитрата.

Микрококки, стафилококки, кокурии широко распространены на пивоваренных предприятиях и в некоторых случаях могут приводить к порче пива. Однако они слабо размножаются при pH 4,5 и ниже, чувствительны к компонентам хмеля. Kokuria varians (ранее Micrococcus varians) иногда выделяется из семенных дрожжей, но является безвредным. Kokuria kristinae представляет собой нетипичный микрококк (является факультативным анаэробом). Штаммы этого вида сравнительно кислото- и хмелетолерантны и могут придавать пиву неспецифический вкус и фруктовый аромат.

Бациллы — грамположительные бактерии, образующие эндоспоры. Споры этих бактерий присутствуют в солоде, они не погибают при кипячении сусла, но затем эти бактерии не могут размножаться в бродящем сусле из-за низкого значения pH, присутствия хмеля. Из солода, сахарного сусла и с оборудования после кипячения были выделены термофильные бациллы видов В. coagulans, В. stearothermophilus.

Присутствие грамотрицательных бактерий в процессе производства пива является весьма нежелательным. К этой группе микроорганизмов относятся уксуснокислые бактерии, представители семейства Еnterobacteriaceae, бактерии родов Zymomonas, Pectinatus, Megasphaera.

Уксуснокислые бактерии — мелкие грамотрицательные палочки, могут быть подвижными или неподвижными, не образуют эндоспор. Строгие аэробы, каталазоположительны и оксидазоотрицательны. Они размножаются в сусле, хранившемся длительное время, в пиве, засевных дрожжах. В жидкой среде ацетобактерии формируют кольца или пленки на поверхности, некоторые штаммы образуют декстрин. Температурный диапазон роста уксуснокислых бактерий 5—40 °С. Они характеризуются устойчивостью к действию хмелевых смол, кислотам (способны размножаться при pH 3,2—2,5), спирту (выдерживают до 8 об. %). Уксуснокислые бактерии подразделяются на роды Acetobacter и Gluconobacter. Представители рода Acetobacter способны окислять спирт сначала до уксусной кислоты, а затем до СО2 и воды. Бактерии рода Gluconobacter морфологически схожи с ацетобактерами, но в отличие от них не окисляют ацетат до СO2 и воды.

Энтеробактерии. В семейство Enterobacteriaceae входят многочисленные роды, среди которых на пивоваренных предприятиях встречаются: Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Obesumbacterium, Proteus, Rahnella, Serratia. Как правило, на пивоваренных предприятиях не обнаруживались бактерии рода Escherichia и патогенных родов Salmonella и Shigella.

В настоящее время известно, что энтеробактерии тормозят или ускоряют процесс брожения и существенно влияют на вкус и аромат готового пива. Ранее считали, что энтеробактерии не могут выживать в неблагоприятных условиях брожения пива, однако они могут существовать в «необнаруживаемом» состоянии, т. е. не выявляются на стандартных диагностических средах. Тем не менее эти бактерии жизнеспособны, но находятся в неактивном состоянии.

Klebsiella terrigena выделяется на разных стадиях производства пива. Бактерии этого вида, в отличие от других бактерий группы кишечной палочки, неподвижны, образуют классическую капсулу. Обладают способностью размножаться при температуре около 10 °С. Пиво, получаемое из сусла, контаминированного К. terrigena, имеет характерный фенольный привкус. Появление этого привкуса связано с дезаминированием тирозина этими бактериями.

Hafnia alvei (синоним Obesumbacterium proteus) также относится к энтеробактериям и представляет собой толстые, короткие, неподвижные, неспорообразующие палочки размером (0,6—1,5) х (1,0—6,0) мкм, часто соединенные в цепочки. Попадает в производство с водой и семенными дрожжами. В пиве размножается в первые сутки брожения, конкурируя за питательные вещества с почкующимися дрожжами. Hafnia alvei тормозит процесс ферментации, в результате чего пиво приобретает высокие значения плотности и pH. Этот вид способен накапливать в пиве метилсульфид, диметилсульфид, n-пропанол, изобутанол, изопентанол, n-бутандиол и диацетил. Еще одной особенностью Hafnia alvei является его способность в анаэробных условиях бродящего сусла восстанавливать нитрат до нитрита. Последний реагирует с аминами и амидами сусла с образованием N-нитрозаминов.

Rahnella aquatilis (ранее называемый Enterobacter agglomerans) — мелкие грамотрицательные палочки размером (2,0—3,0) х (0,5—0,7) мкм. При температуре 25 °С они подвижны, но при 37 °С подвижность утрачивается. R. aquatilis хорошо размножается в охмеленном и неохмеленном сусле независимо от присутствия дрожжей. При нормальной плотности сусла этот вид выживает в ходе процесса пивоварения, накапливаясь в повторно используемых засевных дрожжах. Однако в высокоплотном пиве R. aquatilis погибает при концентрации спирта 11 — 12 об. %. В пиве, полученном из сусла, содержащего до 106 КОЕ/см3R. aquatilis, обнаруживалось ненормально высокое количество диацетила (0,7 мг/ дм3) и диметилсульфида (143 мкг/ дм3). Количество этих соединений в пиве зависит от степени его контаминации данным видом бактерий.

Род Zymomonas включает два вида: Z. mobilis и Z. anaerobia. В пивоварении чаще встречается вид Z. mobilis, представляющий собой короткие, толстые палочки размером (1,0—1,4) х (2,0—6,0) мкм. Клетки располагаются чаще парами, у некоторых штаммов — цепочками или розетками. Встречаются неподвижные и подвижные штаммы. У клеток подвижных штаммов имеются от одного до четырех полярных жгутиков. Z. mobilis осуществляет спиртовое брожение по модифицированному пути Энтнера—Дудорова. Побочными продуктами этого брожения являются ацетальдегид, ацетон, уксусная и молочная кислоты. Штаммы Z. mobilis способны размножаться при высоких концентрациях этанола (до 10-12 об. %).

Анаэробные грамотрицательные палочки. Долгое время считали, что в пиве способны размножаться аэробные и факультативно анаэробные бактерии, однако появилась информация о том, что порчу фасованного пива могут вызывать строго анаэробные палочки. Первые из них были названы Pectinatus cerevisifilus, а в дальнейшем в Германии, Японии, скандинавских странах из пива были выделены новые роды анаэробных палочек — Selenomonas и Zymophilus.

Pectinatus cerevismfilus — слегка изогнутые, грамотрицательные, не образующие спор палочки размером (2,0—3,0) х (0,7—0,9) мкм с закругленными концами, располагаются поодиночке, парами, иногда в виде коротких цепочек. У старых клеток отмечается наличие спиралевидных гифов. Бактерии подвижны за счет полярно расположенного жгутика. Данный вид относится к облигатным анаэробам. Сбраживает глюкозу с образованием уксусной и пропионовой кислот.

Анаэробные грамотрицательные кокки. Из образцов испорченного пива с неприятным запахом были выделены бактерии, идентифицированные как Megasphaera cerevisiae, семейства Veilonaceae.

Megasphaera cerevisiae — слегка удлиненные кокки диаметром 1,3—1,6 мкм, встречаются парами, иногда короткими цепочками. Они неподвижны, не образуют спор. Строгие анаэробы. Размножаются в диапазоне температур 15—37 °С, оптимальная температура — 28 °С. М. cerevisiae не имеет каталазы, не образует индол, не восстанавливает нитраты до нитритов, но продуцирует H2S.

Дикие дрожжи, контаминирующие сусло и пиво, условно разделены на 4 основных типа: 1— дрожжи, ферментирующие сахара; 2 — дрожжи- киллеры; 3 — «дикий» тип культурных дрожжей; 4 — дрожжи, не ферментирующие сахара.

1. Дрожжи родов Saccharomyces, Kluyveromyces, Torulaspora и Zygosaccharomyces имеют общие биохимические признаки, поэтому они могут успешно конкурировать с культурными видами S. cerevisiae и практически не оказывают на них никакого ингибирующего действия. Однако если дикие дрожжи растут с более высокой скоростью, то при последующих ферментациях их количество в семенных дрожжах увеличится. Многие дикие дрожжи не флокулируют, и пиво становится мутным. В пиве, подвергаемом оклейке или обработке другими осветляющими препаратами, присутствие дрожжей-контаминантов может стать причиной опалесцирующей мути. Дрожжи вида S. diastaticus присутствуют не только в процессе брожения, но и дображивания, что даже при низких уровнях контаминации может привести к появлению мути, образованию фенольного и других посторонних запахов и привкусов.

2. Дрожжи-киллеры убивают чувствительные культурные дрожжи, после чего они становятся доминирующими при брожении. Это приводит к формированию неприятного запаха пива и различных дефектов вкуса. В условиях пивоваренного производства наиболее вероятными штаммами дрожжей-киллеров являются Saccharomyces spp.

3. Для большинства сортов пива тот или иной штамм дрожжей или их смесь имеют очень большое значение. Замена одного штамма другим может привести к выпуску пива неудовлетворительного качества. Основными важными свойствами отдельных штаммов дрожжей являются скорость брожения, флокуляция, формирование пенной шапки, характер и количество побочных ароматических продуктов брожения. В случае замены одной культуры дрожжей на другую все указанные характеристики будут отличаться от требуемых.

4. Среди этой группы дрожжей наиболее часто встречаются дрожжи рода Pichia, особенно вид Р. membranifaciens. Дрожжи родов Brettanomyces и Dekkera нуждаются в кислороде, продуктом их обмена является уксусная кислота, а у дрожжей родов Pichia и Williopsis — эфиры, что существенно изменяет органолептические свойства готового пива. На состав контаминирующей микрофлоры пива существенно влияет кислород воздуха. Его доступ к укупоренному пиву создает предпосылки размножения любых аэробных дрожжей, выживших после фильтрования и пастеризации. Дрожжи родов Debaryomyces, Dekkera, Issatchenkia, Pichia и Williopsis способны размножаться в пиве лишь в аэробных условиях. Это же относится и ко многим дрожжам рода Candida.

С целью повышения биологической стойкости пива его пастеризуют или фильтруют через мелкопористые фильтры. В готовом пиве определяют:

• КМАФАнМ — должно быть не более 500 КОЕ в 100 см3;

• колиформные бактерии — не допускаются в 10 см3;

• патогенные бактерии, в том числе сальмонеллы, — не допускаются в 25 см3;

• количество дрожжей и плесеней — не более 40 КОЕ/см3 в сумме.