Генетика - А. В. Сиволоб 2008

Генетична інженерія і методи молекулярної генетики
Методи генної інженерії
Основні ферменти генної інженерії

Головним інструментом для здійснення генно-інженерних операцій є природні Ферменти, які каталізують реакції деградації та синтезу нуклеїнових кислот. Особливе місце серед них належить рестриктним ендонуклеазам (рестриктазам), що здійснюють специфічне розрізання молекули ДНК усередині певних елементів послідовності нуклеотидів. Рестриктази (існує кілька сотень таких ферментів) виконують у бактеріальних клітинах роль захисту від чужорідної ДНК бактеріофагів. Назви цих ферментів утворюються за таким принципом: перша велика літера позначає рід мікроорганізму, дві маленькі - вид, римські цифри та іноді великі літери - порядковий номер рестриктази серед інших рестриктаз даної бактерії. Наприклад, EcoRI - рестриктаза RI із Escherichia coli.

Послідовності нуклеотидів, які впізнаються рестриктазами, відрізняються великою різноманітністю: сайтом рестрикції є невеликі (4, 6, іноді трохи більше пар основ) паліндромні послідовності (такі, що читаються однаково в напрямку 5'-3' по обох ланцюгах, рис. 9.1). Залежно від типу рестриктази, два розрізи, які вона здійснює, можуть бути розташованими точно один напроти одного у двох ланцюгах, що зумовлює утворення так званих тупих кінців. Частіше рестриктази залишають взаємно комплементарні 5'-кінцеві (іноді 3'-кінцеві) одно- ланцюгові вирости - липкі кінці (рис. 9.1).

Рис. 9.1. Приклади рестриктних сайтів (ліворуч, стрілками позначено місця розрізів) та продуктів рестрикції (праворуч). Рестриктази BamHI та NotI залишають липкі кінці з 5'-кінцевими виступами, PstI - із 3'-кінцевими виступами, HpaI - тупі кінці

Крім того, часто використовують різноманітні менш специфічні нуклеази - ферменти, що каталізують реакцію гідролізу нуклеїнових кислот. Нуклеази можуть діяти тільки на молекули ДНК (ДНКази) або РНК (РНКази); вибірково гідролізувати тільки одноланцюгову (нуклеаза S1) або дволанцюгову (екзонуклеаза ІІІ) молекулу ДНК; діяти тільки на гібридну молекулу РНК-ДНК (РНКаза Н) тощо.

Наступний важливий для генної інженерії фермент - ДНК-залежна ДНК-полімераза (див. розділ 1). Найчастіше використовують ДНК-полімеразу І E. coli. Їй притаманні три види каталітичної активності:

✵ полімеразна, що зумовлює синтез ланцюга ДНК у напрямку 5'-3' на одноланцюговій ДНК-матриці у присутності чотирьох нуклеозидтрифосфатів і короткого ДНК-праймера, який має вільну 3'-гідроксильну групу;

✵ 3'-екзонуклеазна, яка спричиняє відщеплення нуклеотидів від 3'-кінця з метою редагування помилок;

✵ 5'-екзонуклеазна, що забезпечує відщеплення нуклеотидів від 5'-кінця полінуклеотидного ланцюга.

За рахунок першої та третьої активностей ДНК-полімераза І одночасно може каталізувати реакцію полімеризації та гідроліз нуклеотидного ланцюга в напрямку 5'-3', починаючи з одноланцюгового розриву у дволанцюговій ДНК. Такий процес називається нік-трансляцією: при цьому розрив (нік) переміщується вздовж ланцюга ДНК у напрямку 5'-3' на відстань до однієї тисячі пар нуклеотидів. Нік-трансляцію використовують, зокрема, для Введення в ДНК радіоактивно мічених нуклеотидів.

Від ДНК-полімерази І за допомогою трипсину або субтилізину можна відокремити великий фрагмент (фрагмент Кленова), що зберігає тільки полімеразну та 3'-екзонуклеазну активності. Відсутність 5'-екзонуклеазної активності дає змогу, зокрема, використовувати фрагмент Кленова для "заповнення" одноланцюгових 5'-кінцевих виступів, що утворюються при розрізанні ДНК рестриктазами.

Також використовують ДНК-полімеразу фага Т4. Їй притаманні ті самі активності, що й фрагменту Кленова, але її 3'-екзонуклеазна активність є у 200 разів вищою. Відповідно, цю полімеразу застосовують для введення мітки до рестриктів із виступами 3'-кінців.

ДНК-лігаза являє собою ще один із найважливіших інструментів генної інженерії. Вона каталізує синтез фосфодіефірного зв'язку між 5'-фосфатним і 3'-гідроксильними кінцями в місці одноланцюгового розрізу (ніка) у дволанцюговій молекулі ДНК. Найчастіше використовують ДНК-лігазу фага Т4, яка здатна в присутності АТР зшивати фрагменти ДНК із липкими кінцями: два взаємно комплементарні липкі кінці утворюють подвійну спіраль з двома ніками (рис. 9.1), які зашиваються лігазою.

Для синтезу ДНК на РНК-матриці використовують РНК-залежну ДНК-полімеразу - зворотну транскриптазу. Назва ферменту пов'язана з тим, що він каталізує реакцію, зворотну першому етапу експресії гена - транскрипції, первинним продуктом реакції є гібрид РНК-ДНК. У генній інженерії зазвичай використовують зворотну транскриптазу з РНК-вірусів птахів (див. розділ 5). Вона складається з двох субодиниць і має щонайменше дві активності: ДНК-полімеразну (може використовувати як матрицю одноланцюгові РНК або ДНК); активність РНКази Н (гідролізує РНК у складі гібрида РНК-ДНК, але не атакує вільну РНК). Таким чином, фермент синтезує на РНК- матриці комлементарну молекулу ДНК (кДНК).

Серед інших різноманітних ферментів, які використовують у генній інженерії, слід згадати термінальну дезоксинуклеотидилтрансферазу, яка може нарощувати НУКЛЕОТИДИ на 3'-кінець одноланцюгової молекули ДНК. З її допомогою можна "підтупити" кінці ДНК (якщо 3'-кінець є коротшим) або подовжити одноланцюгові 3'-кінцеві вирости (безматричний Синтез ДНК - використовуються нуклеотиди, що наявні в реакційній суміші).