Цитологія, загальна гістологія та ембріологія - В. К. Напханюк 2002

Мікроскопи. Техніка мікроскопування
Техніка мікроскопування
Фазово-контрастна мікроскопія

Велика кількість препаратів, у першу чергу незабарвлені живі біологічні об’єкти, не поглинають світла і бувають безбарвні та прозорі. Метод фазового контрасту дає можливість отримувати контрастне зображення цих препаратів, майже невидимих при звичайних методах спостереження. При цьому препарати не потрібно забарвлювати, що завжди шкідливо позначається на живих об’єктах.

Class="center">

Рис. 2. Схема флюоресцентного мікроскопа: 1 — джерело світла; 2 — польова діафрагма колектора; 3,9 — світлофільтри; 4 — дзеркало освітлювача; 5 — конденсор; 6 — препарат; 7 — об’єктив; 8 — окуляр

Метод фазового контрасту полягає в тому, що окремі ділянки структури прозорого препарату відрізняються від навколишнього середовища за показником заломлення. Внаслідок цього світло, яке проходить через них, запізнюється по фазі на величину

s = h (n₀ - n_с)

де h — товщина об’єкта;

n₀, n_с — показники заломлення власне об’єкта та середовища.

В результаті світлова хвиля, яка проходить крізь препарат, зазнає різних змін по фазі і набуває так званого «фазового рельєфу». Однак цей рельєф не сприймається безпосередньо оком або фотопластинкою, які є сприйнятливими і чутливими тільки до зміни інтенсивності світла, що залежить лише від амплітуди світлового коливання. Метод фазового контрасту дає можливість перетворювати фазові зміни на амплітудні, тобто таким чином «фазовий рельєф» замінити на «амплітудний рельєф». У результаті отримується видиме, так зване фазово-контрастне зображення препарату, в якому розподіл освітленості відповідає розподілу фаз.

У зв’язку з викладеним, будова фазово-контрастного мікроскопа має деякі принципові відмінності від звичайного світлового мікроскопа (рис. 3): в передній фокальній площині конденсора замість звичайної ірисової апертурної діафрагми встановлена кільцеподібна. В об’єктиві розташована так звана фазова скляна пластинка з витравленою на ній кільцеподібною канавкою (фазове кільце). Діаметр кільця дорівнює діаметру зображення діафрагми конденсора, отже фазове кільце закриває все світло, яке прямо проходить крізь препарат і об’єктив (суцільні лінії). Дія фазового кільця подвійна. По-перше, воно поглинає значну частину променів, які пройшли прямо; для цього дно канавки вкривається напівпрозорою плівкою металу. По-друге, фазове кільце зсуває фазу світлових коливань на чверть довжини хвилі світла. Відповідно до цього глибина канавки у пластинці повинна дорівнювати приблизно 0,5 мкм. Світло, розсіяне препаратом (переривчасті лінії на рисунку), проходить повз фазове кільце і не зазнає ослаблення або зсуву фази.

Рис. 3. Оптична схема фазово-контрастного мікроскопа:

1 — кільцева діафрагма; 2 — конденсор; 3 — препарат; 4 — об’єктив; 5 — фазова пластинка; 6 — дійсне зображення препарату

Фазова пластинка має таку форму, що промені, не відхилені об’єктом, проходять у пластинці крізь дещо менший шар скла, ніж промені дифраговані. Тому фаза променів, які пройшли прямо, випереджає фазу дифрагованих променів. У площині утворюється так зване позитивне фазово-контрастне зображення препарату. Дрібні частинки, показник заломлення яких більший за показник заломлення навколишнього середовища, мають вигляду темних на світлому фоні. У більш великих об’єктів темними стають тільки краї, середня частина залишається світлою. Всі темні зображення оточені широкими світлими ореолами. Частинки з показником заломлення меншим, ніж у навколишнього середовища, дають зображення світліші, ніж оточуючий фон.