Фізіологія рослин - Мусієнко М.М. 2001

Дихання
Дихальний ланцюг. Окислювальне фосфорилуваиня

Третій, завершальний етап дихання, пов’язаний з транспортом електронів до молекулярного кисню. Всі молекули НАД×Н та ФАД×Н₂, які утворилися в процесі гліколізу, циклу Кребса

Рис. 93. Регуляція циклу трикарбонових кислот окислювального декарбоксилування пірувату: 1 — піруватдегідрогеназа, 2 — цитратсинтетаза, 3 — ізоцитратдегідрогеназа, 4 — α-кетоглутаратдегідрогеназа, 5 — сукцинат дегідрогеназа, 6 — малатдегідрогеназа

несуть значний запас енергії, бо кожна з них містить пару електронів з високим потенціалом перенення. Мітохондріальна система окислювально-відновних реакцій, в якій окислюється віднятий від субстратів водень, має назву дихального ланцюга (рис. 94). Його слід розглядати як важливий механіз біологічного окислення. Це мультиферментна система, яка знаходиться на внутрішній мітохондріальній мембрані. Термінальний ланцюг перенесення електронів складається з ряду сполук, які легко змінюють свою окислювальну та відновну форму. Окислювально-відновні компоненти розміщуються в порядку зменшення від’ємного та збільшення позитивного Е₀

Рис 94. Електрон-транспортний дихальний ланцюг внутрішньої мітохондріальної мембрани

(транспортування відбувається від НАД×Н/НАД⁺ із Е₀ -0,32 В до окислювача 1/О₂/Н₂О із Е_о +0,81 В (рис. 95).

Рис. 95. Термінальний ланцюг перенесення електронів та пункти запасання енергії у мітохондріях рослин. ФП* — флавопротеїновий компонент піруват- і 2-оксоглутаратдегідрогеназних комплексів; ФП_нп і ФП_вп — флавопротеїни дегідрогеназ, які локалізуються відповідно на зовнішній та внутрішній поверхнях внутрішньої мітохондріальної мембрани; ФП_С — сукцинат дегідрогеназа; ФП_hа — флавопротеїн з високим (плюсовим) значенням Е₀ і великою зміною в поглинанні при зміні окислювально-відновного стану; Fes — залізосіркопротеїн; тризначні числа в індексі цитохромів а, b, с — довжина хвилі в нм максимуму поглинання в a-області відповідного цитохрому при кімнатній температурі, пункти 1, 2, 3 — пункти запасання вільної енергії

За винятком убіхінону, всі компоненти ЕТЛ — білки з характерними простетичними групами. До складу ланцюга входять білки трьох типів:

·флавопротеїни — з простетичною групою ФАД або ФМН;

·цитохроми — простетична група — гем;

·запізопротеїни (залізосірчані білки), в яких простетична група складається з негеміново- го заліза, комплексно зв’язаного з неорганічною сіркою або сіркою цистеїну.

В ланцюгу транспортування електронів на ділянці від убіхінону до О₂ розташовані 5 різного класу цитохромів, окислювально-відновний потенціал яких зростає в послідовності:

Ці цитохроми відрізняються за структурою та їхніми властивостями. У зв’язку з тим, що призначення електронтранспортного ланцюга — перенесення електронів від високоенергетичного відновника до О₂, всі компоненти його повинні бути переносниками електронів. Лише деякі з них поряд з електронами переносять також протони: флавопротеїни та убіхінон — переносники водню та електронів, а цитохроми та залізосірчані білки — лише електронів. До того ж, флавопротеїни та убіхінон — двохелектронні переносники, а цитохроми — одноелектронні.

Таким чином, 2е передаються по ЕТЛ через ряд компонентів з поступовим зменшенням електричного потенціалу, доки не досягнуть останнього компонента ланцюга — цитохромокси- дази. Цей фермент використовує ці два електрони (2е^-) разом з двома протонами (2Н⁺) для відновлення одного атома кисню до Н₂О. Тому кожен із компонентів ЕТЛ повинен взаємодіяти одночасно з двома електронами. Це не є проблемою для двохелектронних переносників. Од-

нак одноелектронні переносники повинні працювати парами, тому для перенесення 2е, одержаних від убіхінону, потрібно мати в ланцюгу по дві молекули кожного з цитрохромів.

Більша частина компонентів ЕТЛ вмонтована у внутрішню мітохондріальну мембрану; а цитохром с не досить міцно зв’язаний із зовнішньою поверхнею внутрішньої мембрани. Лише НАД- та НАДФ-дегідрогенази, тобто перша ланка ЕТЛ, слабко зв’язана з мітохондріальною мембраною.

Мітохондрії рослинної клітини відрізняються від тваринних тим, що вони мають НАД×Н-дегідрогеназу, що локалізована на зовнішній поверхні внутрішньої мітохондріальної мембрани. Цей фермент, ймовірно, каталізує перенесення електронів та Н⁺ від молекули НАД×Н, локалізованої в міжмембранному просторі, на молекулу убіхінону. Отже, вона відповідає за окислення НАД×Н, що знаходиться в цитозолі. Справа в тому, що НАД⁺ і НАД×Н не може вільно проникати в інтактну мітохондрію, але вони легко проникають через зовнішню мітохондріальну мембрану.

Отже водень, який формується в різноманітних окислювальних процесах у цитоплазмі, зв’язується спеціальними субстратами та переноситься всередину через мембрану в мітохондрію. Мітохондріальні дегідрогенази підводять цей водень НАД×Н (НАДН×Н) безпосередньо до місця окислення.

Вважають, що дихальний ланцюг мітохондрій складається з чотирьох мультиферментних комплексів: НАД×Н — кофермент Q-оксидоредуктаза, сукцинат-убіхінон-оксидоредуктаза, убіхінон та убіхінол-цитохром-с-оксидоредуктаза. Кожний мультиферментний комплекс можна розглядати як окрему структурну одиницю, що входить в єдиний ЕТЛ (табл. 11).

Слід зауважити, що розглянута нами послідовність ЕТЛ в мітохондріях вищих рослин не може вважатись кінцевим варіантом. В міру поглиблення наших знань можливі зміни в деталях структури електрон-транспортного ланцюга.

Таблиця 11. Компоненти електрон-транспортного ланцюга мітохондрій рослин та їхні стандартні окислювально-відновні потенціали (Е₀)

Окислювальне фосфорилування. В жодній з розглядуваних вище реакцій молекулярний О₂ не бере участі, тоді як поглинання кисню є характерною рисою процесу дихання. Потреба в кисні виникає лише на третьому етапі дихання. Як відмічалося вище, значна доля енергії, яка була раніше зосереджена в молекулі гексози, знаходиться тепер у відновлених переносниках НАД×Н та ФАД×Н₂. З них вона тепер повинна звільнятися на завершуючій стадії дихання, коли ці переносники знову окисляються, віддаючи свої електрони вільному О₂. Так як в даних переносниках знаходяться досить значні запаси енергії, вона повинна звільнятися поступово. Тому в ЕТЛ знаходиться кілька локусів, в яких при перенесенні електронів енергія звільняється та запасається у формі АТФ (рис. 96).

Рис. 96. Передача енергії по ланцюгу переносників електронів у мітохондріальній мембрані. Електрони від NADH переходять від одного переносника до другого, щоразу на більш низький енергетичний рівень і врешті решт, відновлюють 1/2О₂ до Н₂О. У процесі такого перенесення фосфорилуються три молекули АДФ з утворенням АТФ, високоенергетичної сполуки, яку використовують в інших реакціях. Пункти, в яких виникає фосфорилування, помічені поки що ймовірно; можливо, що тут виникає також і переміщення протонів

Причому на кожну молекулу НАД×Н, що передає свої електрони в ЕТЛ, синтезується З АТФ, а на кожну молекулу ФАД×Н₂ дві молекули АТФ. У зв’язку з тим, що АТФ утворюється в результаті окислення кожного попереднього переносника і електрони в кінцевому варіанті переходять на О_г, саме цей процес одержав назву окислювального фосфорилування.

Рушійною силою окислювального фосфорилування є потенціал перенесення електронів, що характерний для НАД×Н та ФАД×Н₂. Можна розрахувати величину окислювально-відновного потенціалу дихального ланцюга при окисленні НАД×Н під дією О₂. Як відомо,

Величина різниці окислювально-відновного потенціалу буде: (+0,82 В) - (-0,32 В) =+1,14

В, а кількість вільної енергії окислення для даної реакції розраховують за формулою:

де п — кількість електронів, що дорівнює 2; F — фарада = 96633,97 Дж; ДЕ — різниця окислювально-відновного потенціалу між ділянками ЕТЛ від -0,32 до +0,82 = 1,14; AG — стандартна зміна вільної енергії; 4G =2 × 96 633,97 Дж × 1,14 =220,8 кДж.

Рис. 97. Схема мітохондріального метаболізму

Отже, потік, електронів в системі від НАД×Н до О₂ являє собою екзергонічний процес, в якому зміна вільної енергії становить близько 220,8 кДж (рис. 97). Вільна енергія гідролізу АТФ дорівнює 30,6 кДж. Враховуючи, що при перенесенні пари електронів від НАД на кисень виділилось 220,8 кДж, можна передбачити ймовірність синтезу 7 молекул АТФ. Однак, було показано, що при проходженні пари електронів в системі утворюється лише 3 молекули АТФ, тобто в електрон-транспортному ланцюгу є три пункти фосфорилування.

Складність самого процесу потребує відповідної структури самих мітохондрій. Кожен фермент повинен розміщуватися таким чином, щоб він зміг прийняти відповідний субстрат, а також передати готовий наступному ферменту в тому ж ряду. Затримка в будь-якій точці ЕТЛ може повністю блокувати транспортування електронів. Синтез АТФ здійснюється специфічним молекулярним комплексом, що знаходиться у внутрішній мітохондріальній мембрані (рис. 98), який за структурою і функціями аналогічний розглянутому нами у тилакоїдній мембрані (див. рис. 98).

Рис 98. Схема комплексу АТФ-синтетази. Частина компонента CF₀ занурена у внутрішню мембрану і проходить крізь неї, а компонент CF₁, який складається із дев'яти субодиниць, вдається у мітохондріальний матрикс: 1 — зовнішнє середовище, 2 — внутрішня мембрана мітохондрії, 3 — мітохондріальнии матрикс

Згідно з хеміосмотичною теорією Мітчела, перенесення електронів по ЕТЛ зумовлює викидання протонів із матриксу в компартмент внутрішньої мітохондріальної мембрани, де в результаті зростає концентрація іонів IT. Генерується мембранний потенціал з позитивним зарядом на цитоплазматичній стороні мембрани, який і запускає синтез аденозинтрифосфату АТФ- синтетазним комплексом. Це вимагає, щоб переносники в дихальному ланцюгу та АТФ-синтетаза мали векторну організацію (рис. 99).

Рис. 99 Генерація мембранного потенціалу на зовнішній стороні мембрани мітохондрії

Крім того, внутрішня мітохондріальна мембрана повинна бути абсолютно непроникною для протонів, бо для формування протонного градієнта потрібний замкнутий компартмент. Первинним запасаючим енергію актом є перенесення протонів крізь внутрішню мітохондріальну мембрану. Насправді, нереносники електронів розміщені асиметрично на внутрішній стороні мембран мітохондрій. У зв’язку з тим, що деякі з них переносять не лише електрони, а й протони між двома сторонами внутрішньої мембрани, виникає градієнт концентрації протонів. Відомо, що pH зовні мембрани на 1,4 одиниці нижче, ніж з внутрішньої, що утворює потенціал 0,14 В. Подібні процеси спостерігаються і в тилакоїдній мембрані хлоропластів. Єдина різниця заключається в тому, що протони транспортуються зсередини назовні так, що з внутрішнього боку мітохондріальна мембрана виявляється більш лижною, а із зовнішнього — більш кислою. Перенесення

кожної пари електронів по ЕТЛ від НАД×Н до 1/2О₂ спричинює перехід через мітохондріальну мембрану 6 іонів Н⁺. Виникає значний градієнт pH між різними сторонами мембрани, який і виступає потенціальним джерелом енергії (рис. 100).

Протонний градієнт генерується в трьох пунктах на шляху електронів по дихальному ланцюгу від НАД×Н до О₂ а саме:

Рис. 100. Модель фосфорилування у дихальному ланцюгу згідно з хеміосмотичною теорією: 1 — матрикс, 2 — внутрішня мембрана, 3 — зовнішня мембрана, 4 — криста

НАД×Н — Q-редуктазний комплекс. QH₂ — цитохром с-редуктазний комплекс та цитохром с-оксидазний комплекс.

Доведено, що всі ці три комплексні системи наскрізь пронизують внутрішню мітохондріальну мембрану. Ймовірно, що транспортування електронів зумовлює поперемінно конформаційні зміни, які сприяють переходу протонів від матрикса на цитоплазматичну сторону мембрани.

Енергія, яка виділяється при зворотному транспортуванні протонів, тобто при переміщенні їх всередину мітохондрій по особливих каналах в грибоподібних виростах, і використовується за участю специфічного кофактора (фактора спряження) на синтез АТФ із АДФ та Ф_н. (фосфору неорганічного).

Гіпотеза Мітчела постулює, що електрохімічний градієнт іонів Н⁺ на внутрішній мембрані виступає рушійною силою для АТФ-синтетази, яка каталізує фосфорилування АДФ.

Ця сила одержала назву протонрушійної сили. Вона складається з градієнта pH та градієнта електричного потенціалу, зумовленого нагромадженням іонів Н⁺ на зовнішній поверхні внутрішньої мембрани та аніонів (наприклад, ОН ) на внутрішній поверхні. Градієнт pH 1,5 спричинює різницю електричного потенціалу в 1,5 В.

Яким же чином електрохімічний градієнт іонів Н⁺ забезпечує фосфорилування?

Суть у тому, що синтез АТФ з АДФ та неорганічного фосфору включає видалення елементів води із цих двох субстратів, а саме АДФ втрачає Н⁺, а ортофосфат втрачає ОН^-. Ця реакція каталізується АТФ-синтетазою, яка вмонтована у внутрішню мітохондріальну мембрану. Нагадаємо, що АТФ-синтетаза — це мультибілковий комплекс, який складається з сферичної головки (компонент (CF₁), короткої ніжки та внутрішньомембранної частини (компонент (CF₀). Фізіологічна роль СF₁ заключається в тому, щоб каталізувати синтез АТФ (рис. 101).

Згідно з теорією Мітчела, при зв’язуванні в активному центрі АТФ-синтетази АДФ та Ф_н, які надходять із матрикса, Н⁺ та ОН, що виділяється при синтезі АТФ, транспортуються в протилежних напрямках з допомогою електрохімічного градієнта, а саме: H⁺ переноситься в матрикс, бо його туди притягують надлишки ОН та електровід’ємність матрикса. Тоді як іони ОН^-

Рис. 101. Синтез АТФ в мітохондріях

залишаються в міжмембранному просторі, АТФ, яка утворюється в цьому процесі, звільняється в матрикс. Більшість біохіміків вважає дану теорію найбільш близькою до реального, механізму окислювального ФФ (рис. 102).

Слід зауважити, що АТФ та АДФ не можуть вільно дифундувати крізь внутрішню мембрану мітохондрій, причому АДФ надходить в мітохондріальний матрикс лише за умови виходу з ньо-

Рис. 102. Механізм утворення АТФ при окислювальному фосфорилуванні: А — протонний насос; Б — фосфорилування за участю АТФ-ази: а — зовнішня сторона мембрани, б — внутрішня сторона мембрани

го АТФ і навпаки. Забезпечує обмін АТФ-АДФ-транслоказа, димер, що складається з ідентичних субодиниць масою 29 кДа кожна. Вона становить до 6% всього білка у внутрішній мітохондріальній мембрані. Крім того, мітохондрії мають інші численні транспортні системи для іонів і метаболітів (рис. 103). Електрони, як правило, переносяться по дихальному ланцюгу лише за умови одночасного фосфоритування АДФ в АТФ. Регуляцію швидкості окислювального

Рис. 103. Найважливіші транслокатори внутрішньої мітохондріальної мембрани. Фосфат і АТФ-АДФ-транслокатори показані на рис. 101.

фосфоритування АДФ називають дихальним контролем. За відсутності потреби синтезу АТФ перенесення електронів на кисень не відбувається.

В деяких випадках можливе безпосереднє використання енергії протонного градієнта (ΔμН⁺). Дійсно, внаслідок того, що внутрішня сторона мембрани виявляється електровід’ємною, виникає трансмембранний потенціал. Катіони внаслідок електричного притягування постійно надходять та накопичуються у внутрішньому просторі мітохондрій. Є дані, що протонний градієнт може забезпечити навіть надходження вуглеводів, наприклад при завантаженні сахарози в ситовидні трубки. Отже, протонний градієнт забезпечує осмотичну роботу та перенесення деяких речовин проти градієнта їх концентрації. Важливо зазначити, що (ΔμН⁺) може використовуватись також як транспортна форма енергії, що передається вздовж мембрани.

Таким чином, клітина володіє двома формами використання енергії — у вигляді АТФ та (ΔμН⁺). АТФ — макроергічна сполука, розчинна у воді, тому легко використовується у водній фазі. Енергія протонного градієнта (ΔμН⁺) — електрохімічна, вона нерозривно пов’язана з мембраною. Обидві форми енергії можуть взаємно перетворюватись. Так, в процесі утворення АТФ використовується енергія (ΔμН⁺), тоді як при розкладанні АТФ енергія акумулюється в (ΔμН⁺):