Молекулярная биология: Структура и функции белков - Степанов В.М. 2005

Выделение белов
Перспективы использования белковой инженерии для выделения белков

Методы генной инженерии позволяют присоединять к структурному гену белка последовательности, кодирующие такие Белки или их фрагменты (домены), которые облегчают выделение конструкции в целом. Полученный гибридный («химерный») белок во многих случаях, хотя и не всегда, жизнеспособен, причем обе части «химеры» независимо друг от друга свертываются в компактные структуры. Это дает возможность, используя характерные свойства присоединенной к целевому белку структуры, провести специфическое выделение гибрида, после чего расщепить «шарнир», соединяющий обе его части.

Так, белки-гибриды, в которых одной из составных частей является белок А стафилококков, могут быть очищены хроматографией на колонках, содержащих присоединенные ковалентно Иммуноглобулины. Белок А прочно связывается с последними. Гибридные белки, в состав которых входит ß-галакгозидаза или ее крупные фрагменты, могут быть очищены на колонках, специфически сорбирующих этот фермент, например содержащих ковалентно связанный аналог субстрата — аминофенилтиогалактозид. По завершении очистки гибридный белок подвергают ограниченному протеолизу или расщепляют связь между объединенными в его структуре белками специфическими химическими методами, например действием бромциана, и отделяют «целевой» белок от белка-носителя, что, как правило, не составляет затруднений.

Иногда к структурному гену белка присоединяют олигонуклеотидные фрагменты, которые кодируют короткие аминокислотные последовательности, наращивающие этот белок с аминного или карбоксильного конца. Эти последовательности выбирают так, чтобы они не препятствовали свертыванию белка и в то же время сообщает всей конструкции то или иное характерное свойство, которое позволяет легко выделить такую молекулу даже из очень сложной смеси. Затем эти фрагменты отщепляют в мягких условиях.

Так, присоединение к карбоксильному концу дегидрофолатредуктазы Lys—Gly—Ser—Arg—Ser двух остатков гистидина дает последовательность Lys—Gly—Ser—Arg—Ser—His—His. Соседствующие остатки гистидина образуют комплекс с ионом Ni²⁺, который удерживается специально полученным сорбентом с хелатирующими группами. Это позволяет в одну стадию выделить клонированный в E.coli фермент из культуральной жидкости практически чистым, с 90%-м выходом. Отщепление обоих остатков гистидина карбоксипептидазой А приводит к дегидрофолатредуктазе с С-концевой последовательностью Lys—Gly—Ser—Arg.

Предложено к аминному концу рекомбинантных белков-лимфокинов присоединять последовательность Asp—Туг—Lys—Asp- Asp—Asp—Asp—Asp—Lys, которую связывает специально полученное антитело. После очистки белка (модифицированного присоединением такой последовательности) иммуносорбцией его обрабатывают энтеропептидазой — ферментом, специфически отщепляющим этот пептид (см. гл. 11). По-видимому, описанный подход особенно перспективен для выделения и очистки рекомбинантных белков.