МИКРОБИОЛОГИЯ БИОЛОГИЯ ПРОКАРИОТОВ ТОМ III - А. В. ПИНЕВИЧ - 2009

ГЛАВА 16. ЦИТОГЕНЕТИКА

16.5. Консерватизм геноиа

Прокариотный геном, как геном любого живого существа клеточного или неклеточного строения, служит плацдармом для реализации процессов наследственности и изменчивости. Чтобы он оставался консервативным, т. е. воспроизводил свою структуру в цепи поколений, требуется не только исправлять возникающие изменения, но и устранять их причины.

Ярким примером эволюционной консервативности, приводящей к сохранению общей геномной организации, являются энтеробактерии. В частности, генетические карты Е. coli К-12 и Salmonella enterica серовар Typhimurium обнаруживают очень высокое сходство друг с другом, несмотря на то, что эти бактерии дивергировали >100 млн. лет назад. Высокое взаимное сходство проявляют и физические карты геномов Е. coli, Salmonella enterica серовар Typhimurium, S. enteritidis и S. paratyphi штамм В.

Наследуемые изменения прокариотного генома являются результатом мутаций и рекомбинационных процессов. В частности, частота некомпенсированных мутаций отражает соотношение между общим числом повреждений ДНК и числом репарированных или неверно репарированных повреждений. Иными словами, мутации реализуются в силу ограниченных возможностей репарационных систем и их ошибок.

Таким образом, за консерватизм генома прежде всего отвечают репарационные системы, которые распознают повреждения ДНК и их исправляют.

Наряду с этим за консерватизм генома отвечают превентивные системы, которые защищают его от генов чужого происхождения. Такие системы, или системы рестрикции-модификации, избирательно повреждают чужеродную ДНК, не причиняя вреда собственному геному. Рестрицированная ДНК теряет способность копироваться и экспрессироваться в ущерб клетке-хозяину. При помощи систем рестрикции- модификации бактерии, в первую очередь, борются с вирусной инфекцией. Кроме того, благодаря этим системам бактерии избегают геномных изменений, источником которых может стать рекомбинация между резидентной и чужеродной ДНК. Поэтому допустима аналогия между системами рестрикции-модификации, которые различают свою и чужую ДНК, и иммунной системой высших ядерных организмов, которая отличает собственные белки от чужеродных белков.

16.5.1. Репарация

Молекула двухцепочечной ДНК обладает жестким сахарофосфатным скелетом и стабилизирована множеством водородных связей, которые образуются между комплементарными парами азотистых оснований. Как таковая, ДНК относительно устойчива к структурным изменениям и повреждениям. Однако они постоянно

возникают под воздействием внешних факторов или происходят вследствие эндогенных метаболических процессов.

Среди главных повреждающих ДНК экзогенных химических и физических агентов можно назвать бенз(а)пирен, диоксины, полихлорированные бифенилы и ультрафиолетовый свет. В свою очередь, важнейшими эндогенными повреждающими агентами являются активные формы кислорода, например, синглетный кислород, и активные формы азота, в частности пероксинитрит (см. раздел 19.1.6.1).

Другим источником структурных повреждений ДНК служат эндогенные ошибки, которые неизбежно, хотя и с разной частотой, происходят при нормальном метаболизме ДНК, а также ее процессинге, состоящем из репликации, рекомбинации и репарации.

В частности, разные ДНК-полимеразы допускают ошибки с разной частотой. Относительно мало ошибаются репликативные ДНК-полимеразы Pol I и Pol III, а также репарационная SOS- репликаза Pol II, которые обладают способностью к автокоррекции. Напротив, репарационные SOS-репликазы Pol IV и Pol V характеризуются тем, что проходят участок повреждения, оставляя его неисправленным (см. раздел 16.4.1.1).

К числу структурных изменений ДНК относятся (рис. 189):

— разрывы фосфодиэфирных связей (одноцепочечные или двухцепочечные);

— димеризация оснований, т. е. образование ковалентных связей между двумя соседними пиримидиновыми основаниями в одной и той же цепи или в комплементарных цепях;

— нарушение спаривания, т. е. отсутствие канонического спаривания нуклеотидов либо из-за удаления основания, либо по причине использования «неправильного» основания;

— образование аддуктов, или продуктов присоединения простых органических молекул, например, алкилирующих агентов.

Рис. 189. Основные типы структурных изменений и повреждений в двухцепочечной ДНК.

Самыми опасными повреждениями ДНК являются разрывы цепей, димеризация оснований или локальное отсутствие спаривания; если они вовремя не устраняются, происходит полная блокада репликации и транскрипции.

С другой стороны, результатом неустраненной ошибки спаривания становятся точечные мутации, которые вносят изменения в нуклеотидную последовательность ДНК. Точечные мутации не влияют на репликацию и транскрипцию в той клетке, где они появились. Однако они наследуются и могут фенотипически проявиться у потомства.

Таким образом, повреждения ДНК снижают точность репликации и транскрипции, а в отдельных случаях могут вообще заблокировать эти процессы, что приводит к летальным последствиям.

Чтобы свести опасность к минимуму, в клетках имеются множественные репарационные системы (англ. repair — ремонтировать). Они распознают и устраняют структурные повреждения ДНК.

Репарация ДНК может осуществляться разными способами.

Некоторые повреждения структурно обратимы, и поэтому непосредственно исправляются путем возвращения ДНК в исходное состояние. Примером служит фотореактивация с помощью фотолиазы, которая мономеризует пиримидиновые димеры, образовавшиеся под воздействием ультрафиолетового света (см. раздел

16.5.1.1).

При так называемой эксцизионной репарации точечный поврежденный участок в одной нити ДНК удаляется вместе с фланкирующими интактными областями, длина которых может сильно варьировать. «Правильному» заполнению образовавшейся одноцепочечной бреши способствует двухспиральная структура ДНК, так как неповрежденная комплементарная цепь играет роль матрицы.

При эксцизионной репарации с удалением основания (см. раздел 16.5.1.2) ДНК-гликозилаза удаляет модифицированное основание. Затем разрывается фосфодиэфирная связь по 5'- положению апиримидинового или апуринового сайта. После этого происходит ник-трансляция (от англ. nick — разрез; в данном случае — перенос разреза) — отрезается нуклеотид, фланкирующий повреждение по 3'-положению. Образовавшаяся минимальная брешь заполняется с помощью ДНК-полимеразы, а ДНК-лигаза ликвидирует разрез.

При эксцизионной репарации с удалением нуклеотидов (см. раздел 16.5.1.2) небольшой сегмент ДНК (~11 н.; поврежденный сайт с фланкирующими последовательностями) вырезается эксцизионной эндонуклеазой; брешь и разрез устраняются, как в предыдущем случае.

При репарации нарушенного спаривания, которая избирательно затрагивает неметилированную цепь ДНК (см. раздел 16.5.1.3), вместе с точечным повреждением удаляется участок ДНК протяженностью до 1 тыс нуклеотидов.

Рекомбинационная репарация (см. раздел 16.5.1.4) служит для ликвидации двухцепочечных повреждений, которые возникли либо при репликации ДНК, уже имеющей одноцепочечное повреждение, либо в результате внешнего воздействия на нереплицирующуюся молекулу. Смысл рекомбинационной репарации заключается в том, чтобы путем обмена гомологичными участками распределить двухцепочечное повреждение между двумя дуплексами ДНК. В результате два одноцепочечных повреждения устраняются в ходе репликации или с помощью пострепликационной эксцизионной репарации.

16.5.1.1. Фотореактивация

В природных условиях главным физическим фактором, который вызывает повреждение ДНК, является солнечная радиация, в частности ее коротковолновый компонент, или ультрафиолетовый свет. Он активно поглощается сопряженной системой двойных связей, что дестабилизирует молекулярные структуры и может приводить к их химической перестройке.

Одним из важнейших эволюционных приспособлений к существованию в нишах, облучаемых ультрафиолетом, служит фотореактивация (для защиты от повреждений видимым светом используются другие механизмы; см. раздел 19.1.6.1).

Сообщения об открытии феномена фотореактивации (англ. photoreactivation) почти одновременно опубликовали в начале 1949 г. два американских генетика — Кельнер (А. Keiner) и Дальбекко (R. Dulbecco). Первый продемонстрировал его на актинобактерии Streptomyces gris eus, второй на примере Т-бактериофага Е. coli.

Феномен фотореактивации заключается в том, что выживаемость клеточных организмов и вирусов, подвергнутых воздействию природного или искусственного «дальнего» ультрафиолетового света (200 -300 нм), можно повысить сразу на несколько порядков, облучая их «близким» ультрафиолетовым светом (300- 350 нм) или видимым светом длиной волны 350 -500 нм. Способностью к фотореактивации обладает большинство живых существ; исключения редки и незакономерны (бактерии Haemophilus influenzae и В. subtilis, археот Methanococcus vannielii, дрожжевой гриб Schizosaccharomyces pombe, плацентарное млекопитающее Н. sapiens).

У разных бактерий спектр действия фотореактивации может различаться. Например, для S. griseus он имеет оптимум при 436 нм, а для Е. coli — 365 нм, что указывает на разную природу фоторецепторных молекул, в частности флавинов.

Последствием облучения ультрафиолетовым светом является образование внутримолекулярных фотопродуктов (пиримидин:6-4 пиримидон) и особенно — спонтанное насыщение двойных связей в положении 5-6 у соседствующих остатков тимина или цитозина. Во втором случае образуется циклобутановое кольцо, или пиримидиновый димер Руr ⇄ Руr (рис. 190). Димеризующиеся пиримидиновые остатки могут находиться либо в одной и той же цепи ДНК («цис-син» кольцо), либо в двух комплементарных цепях («транс-син» кольцо).

Рис. 190. Образование циклобутанового кольца при «димеризации» соседних остатков тимина в одной и той же цепи ДНК.

В отсутствии репарации образование димеров блокирует репликацию, что вызывает летальный эффект. В редких случаях, когда ДНК реплицируется в обход поврежденного сайта, возникает мутация.

Устранить пиримидиновые димеры можно двумя способами — путем фотореактивации или путем эксцизионной репарации (см. ниже).

Механизм фотореактивации заключается в ферментативной регенерации мономерных пиримидиновых оснований из димеров.

Фотореактивация осуществляется при помощи фотореактивирующего фермента (англ. photoreactivating enzyme, PRE), или светозависимой ДНК-фотолиазы (англ. DNA photolyase; dcoxyribocyclobutadipyrimidine pyrimidinelyase). Фермент состоит из одной субъединицы (55 -60 кДа; ген phr2) и содержит два нековалентно связанных хромофора. Первым из них универсально служит ФАДН2 (см. II том учебника). Вторым хромофором у ферментов «фолатного» класса является фолат (N-метинил-Н4фолат), а у ферментов «деазафлавинного» класса деазафлавин (8- гидрокси-5-деазафлавин, F420; там же).

Циклобутановое кольцо разрывается за счет поглощенной энергии света, причем хромофоры поочередно играют роль антенны (см. II том учебника). Реакцию, катализируемую ДНК-фотолиазой, можно записать следующим образом:

Фермент независимо от света связывается со своей мишенью (Руr ⇄ Руr). Затем второй хромофор поглощает световой квант; энергия возбуждения передается первому хромофору, который переносит электрон на циклобутановое кольцо. В результате этого связи 5-5 и 6-6 разрываются, и пиримидиновый димер распадается на мономеры. От одного из них (Руr-) электрон переносится обратно на флавин, который возвращается в исходное состояние, а фермент диссоциирует от ДНК. Таким образом, реакция фотолиза Руг ⇄ Руг —>2 х Руr не относится к числу окислительновосстановительных превращений.

Второй тип фотопродуктов, 6-4 пиримидин-пиримидон, репарируется при помощи особой фотолиазы (ген рhr1). Данные относительно ее молекулярного строения и механизма действия еще не получены.

16.5.1.2. Эксцизионная репарация

Эксцизионной репарацией называется удаление поврежденного участка ДНК с его последующей заменой новым. Репарация такого типа представляет собой высоко точный процесс, поскольку благодаря комплементарности цепей ДНК информация, необходимая для исправления повреждения в одной цепи, считывается с другой, неповрежденной цепи.

В соответствии с молекулярным механизмом, который используется для исправления повреждений, различают две системы эксцизионной репарации.

При репарации с удалением основания поврежденный нуклеотид поэтапно вырезается, причем сначала с помощью гликозилазы удаляется поврежденное основание. Кроме того, компоненты этой системы могут репарировать сайты с отсутствующим основанием, а также димеры оснований, одноцепочечные разрывы или короткие одноцепочечные бреши в молекуле ДНК.

При репарации с удалением нуклеотидов поврежденный участок цепи (реже — один нуклеотид) вырезается за один этап.

Репарация с удалением основания. Исправление разнообразных, чаще всего точечных повреждений ДНК достигается в процессе репарации с удалением основания (англ. baseexcision repair, BER). Она включает в себя следующие этапы:

— удаление «неправильного» основания;

— расщепление сахарофосфатного скелета в сайте с удаленным основанием;

— удаление сахарофосфатного остатка;

— репарационный синтез ДНК;

— лигирование одноцепочечного разрыва.

Первым шагом при репарации с удалением основания является либо спонтанная потеря основания, либо удаление «неправильного» основания при помощи ДНК- гликозилазы (рис. 191).

Рис. 191. Образование бреши размером в один нуклеотид при эксцизионной репарации с удалением основания. I — ДНК-гликозилаза; II — эндонуклеаза АР II; III — экзонуклеаза.

В зависимости от субстратной специфичности ДНК-гликозилаз существуют разные варианты системы репарации с удалением поврежденного или «неправильного» основания. Например, в случае Е. coli ДНК-гликозилаза MutM удаляет 4,6-диамино-5-формамидопиримидин, ДНК-гликозилаза MutY — 8-оксогуанин, ДНК-гликозилаза Ung — урацил, ДНК-гликозилазы Tag и AlkA — алкилпурины, ДНК-гликозилаза TG — тимингликоль (см. рис. 191).

Атипичные ДНК-гликозилазы Micrococcus luteus (PD) и колифага Т4 (DenV+) одновременно обладают двумя активностями — гликозилазной, специфичной в отношении пиримидиновых димеров, и АР-эндонуклеазной. Это позволяет им инициировать процесс репарации, который завершается фотореактивацией (рис. 192).

Рис. 192. Удаление основания и образование одноцепочечного разреза при эксцизионной репарации тиминового димера с помощью гликозилазы/эндонуклеазы РD (DеnV+). N — один из четырех дезоксирибонуклеотидов; Т = Т — тиминовый димер. Черные стрелки — места действия экзонуклеазы (дезоксирибофосфодиэстеразы) и ДНК-фотолиазы.

В результате гидролиза N-гликозильной связи «неправильное» основание освобождается, а в молекуле ДНК появляется апиримидиновый или апуриновый сайт (англ. apurinic/apyrimidinic, АР). Затем эндонуклеаза AP II расщепляет фосфодиэфирную связь в 5'-положении AP-сайта. В результате этого у разорванной цепи появляется свободный 3'-конец, который служит затравкой для синтеза ДНК. В свою очередь, апуриновый или апиримидиновый дезоксирибозо-5-фосфатный остаток удаляется с помощью экзонуклеазы III (дезоксирибофосфодиэстеразы). При этом образуются брешь размером в один нуклеотид и свободный 5'-фосфатный конец, необходимый для воссоединения одноцепочечного разрыва ДНК.

Брешь размером даже в один нуклеотид потенциально летальна. Однако обычно она заполняется с помощью ДНК-полимеразы Pol I (см. раздел 16.4.1.1).

После заполнения бреши, иными словами, по завершении репарационного синтеза в ДНК остается потенциально опасный одноцепочечный разрез (англ. nick) с двумя противостоящими группами — 3'-гидроксильной и 5'-фосфорильной. Он устраняется непосредственно, путем образования фосфодиэфирной связи с помощью, НАД- зависимой ДНК-лигазы, которая кратко охарактеризована в разделе 16.4.1.1.

Репарация с удалением нуклеотидов. Как отмечалось ранее, ультрафиолетовое облучение приводит к образованию внутримолекулярных 6-4 фотопродуктов и циклобутановых пиримидиновых димеров. Для устранения этих повреждений наряду с механизмом фотореактивации используется универсально распространенный механизм — репарация с удалением нуклеотидов (англ. nucleotide excision repair, NER). В данном случае специальный белковый комплекс распознает повреждение в ДНК и непосредственно (т. е. без образования АР-сайта, в отличие от репарации с удалением нуклеотида) наносит фланкирующие одно цепочечные разрезы. Действуя в качестве инцизионной эндонуклеазы (от англ. incision — разрез), он проявляет широкую специфичность в отношении разнообразных одноцепочечных повреждений ДНК, что, в частности, показано на примере Е. coli. К числу продуктов локальной модификации ДНК относятся ииримидин:6-4 пиримидон, аддукты псоралена, производные бенз(а)пирена и т. д.

Хотя принцип действия систем репарации с удалением нуклеотидов в целом одинаков и, в частности, заключается в нанесении разрезов по обеим сторонам от повреждения, белковые компоненты этих систем и кодирующие их гены различаются между собой у разных организмов.

Репарация с удалением нуклеотидов происходит следующим образом. Вначале наносятся два разреза, фланкирующие поврежденный сайт. Затем поврежденный фрагмент ДНК удаляется. После этого осуществляется репарационный синтез ДНК, причем комплементарная цепь служит матрицей для воссоздания удаленного фрагмента. В заключение происходит лигирование одноцепочечного разреза.

В случае бактерий в систему репарации с удалением нуклеотидов входят следующие компоненты, или NER-белки:

— UvrA (сокр. англ. ultraviolet repair; 114 кДа; распознает повреждения);

— UvrB/UvrC (84 и 70 кДа; наносят разрез по обеим сторонам повреждения);

— UvrD (75 кДа; ДНК-геликаза II; расплетает ДНК по обе стороны от повреждения, образуя репарационный «глазок»).

Несмотря на то, что существует определенный базовый уровень конститутивной экспрессии NER-белков, они находятся под контролем регуляторной системы RecA/LexA и индуцируются при SOS-ответе (см. раздел 18.1.2). В частности, белок LexA непосредственно служит репрессором гена uvrA за счет способности связываться с его промотором.

Для проявления активности эндонуклеазы UvrABC необходимы АТФ и катионы Mg2+. Разрезы наносятся по обе стороны от повреждения, например, пиримидинового димера, в результате чего образуется свободный фрагмент ДНК (рис. 193).

Рис. 193. Образование одноцепочечных разрывов, фланкирующих тиминовый димер, при эксцизионой репарации с удалением нуклеотидов.

После того, как эндонуклеаза UvrABC нанесла разрезы, она вместе с олигонуклеотидным фрагментом некоторое время остается в комплексе с ДНК. Затем они вытесняются с помощью четвертого NER-белка, или геликазы UvrD при участии ДНК-полимеразы I и SSB-белков (см. раздел 16.4.1.1).

По сравнению с двухцепочечной ДНК одноцепочечная ДНК более чувствительна к повреждениям; кроме того, отсутствует матрица для ее репарации. Поэтому особая функция SSB-белков состоит в том, чтобы контролировать плавление и отжиг одноцепочечной ДНК, помогать выявить ее повреждение и привлекать к ней белки, участвующие в репарации.

Неудивительно, что SSB-белки имеются у всех клеточных организмов, а также у многих вирусов. Стандартным доменом SSB-белка, служащим для связывания ДНК, является ОВ-складка (сокр. англ. outer binding). Бактерии образуют гомотетрамерные SSB-белки, содержащие одну ОВ-складку в каждой субъединице. В свою очередь, эукариоты образуют гетеротримерные SSB, или репликационные белки А (англ. réplication protein A, RPA) с шестью ОВ-складками. Что касается архей, то SSB-белки Euryarchaeota обнаруживают более высокий уровень гомологии с RPA-белками, в то время как SSB-белки Crenarchaeota имеют химерную бактериально-эукариотную природу.

Брешь, размер которой в 99% случаев составляет ~ 12-13 нуклеотидов, заполняется с помощью ДНК-полимеразы I, а одноцепочечный разрыв зашивает ДНК- лигаза.

Каковы особенности системы репарации с удалением нуклеотидов, имеющейся у архей? В некоторых случаях она сходна с бактериальной, в частности геномы ряда метаногенов и экстремальных галофилов содержат ортологи генов uvrABC (что может объясняться горизонтальным переносом генов); в других случаях археогная NER-система ближе к эукариотной.

16.5.1.3. Репарация ошибок спаривания

Одним из важнейших репарационных механизмов служит репарация ошибок спаривания (англ. mismatch repair, MMR). По характеру производимых действий существует определенное сходство между этой системой и системой репарации с удалением нуклеотидов; кроме того, они используют ряд общих белковых компонентов.

С помощью MMR-системы исправляется локальное отсутствие канонического спаривания по причине включения «неправильного» нуклеотида в растущую цепь ДНК. MMR-система обладает широкой субстратной специфичностью в отношении mismatch-сайтов или небольших делеций. При ее низкой эффективности, а также вследствие ее дефектности происходят наследственные мутации.

Наиболее изучена MMR-система Е. coli. В ее состав входят следующие функциональные белковые компоненты:

— MutS, MutL и MutH;

— ДНК-геликаза II UvrD (MutU);

— экзонуклеазы Exo I, Exo VII, Exo X и RecJ;

— SSB-белки;

— голофермент ДНК-полимеразы Pol III;

— ДНК-лигаза.

Белки MutSLH инициируют процесс MMR и действуют в качестве его координаторе.

Белок MutS обладает АТФазной активностью и образует гомодимеры. Он специфически распознает «неправильный» нуклеотид и взаимодействует с ним. За образование связи отвечают два консервативных аминокислотных остатка — Glu38 и РhеЗ6.

Белок MutL также обладает АТФазной активностью и образует гомодимеры. Он физически взаимодействует с гомодимером (MutS)2. Его роль особенно важна — он не только способствует распознаванию mismatch-сайта, но и отвечает за сборку функциональной MMR-системы. В частности, он активирует белок MutH, а также вовлекает в процесс репарации ДНК-геликазу II UvrD (MutU) и корректирует ее действие. Наконец, он участвует в репарационной репликации, обеспечивая физическое взаимодействие MMR с субъединицами «загрузочного» 7-комплекса ДНК- полимеразы Pol III (см. раздел 16.4.1.1).

Белок MutH, принадлежащий к семейству рестриктаз типа II (см. раздел 16.5.2), функционирует в мономерной форме. Он распознает неметилированные последовательности GATC в новой цепи ДНК и наносит в ней специфический разрез.

Напомним, что при репликации новая цепь ДНК временно не метилируется (см. раздел 16.4.1.1), т. е. отличительным признаком новой цепи служит присутствие в ней неметилированных последовательностей GATC. Для MMR-системы этот критерий используется при выборе цепи, подлежащей репарации. Целесообразность такой стратегии очевидна — ошибка спаривания, которая могла бы вызвать точечную мутацию, исправляется только за счет новой цепи, а старая цепь не затрагивается, что гарантирует сохранение первоначальной структуры генома.

Первым этапом MMR-репарации является связывание комплекса (MutS)2/ (MutL)2/MutH с mismatch-сайтом. На 5'- или 3'-стороне этого сайта выявляется неметилированная последовательность GATC, и в ней делается разрез. Он служит сайтом, который инициирует вырезание новой цепи участка, содержащего неспаренный нуклеотид.

Механизм, с помощью которого MMR-система распознает два взаимно дистанцированных сайта (mismatch-сайт и GATC-сайт), точно неизвестен.

Согласно «стационарной» модели, под воздействием MMR-белков, прежде всего MutS, ДНК изгибается или образует петлю, благодаря чему эти сайты сближаются, в то время как гетеродимер MSH сохраняет связь с mismatch-сайтом. Согласно альтернативной «мобильной» модели, комплекс MutSL связывается с mismatch-сайтом, а затем перемещается от него по направлению к сайту разреза, куда поступают экзонуклеазы. В обоих случаях в качестве источника энергии используется АТФ.

ДНК-геликаза II MutU связывается с разрезом и, начиная от него, расплетает гетеродуплекс ДНК по направлению к mismatch-сайту. Одноцепочечные участки ДНК в «глазке» покрываются SSB-белками, которые защищают их от нуклеаз.

Затем 3' —> 5' экзонуклеаза (Exol или ЕхоХ) или 5' —> 3' экзонуклеаза (ExoVII или RecJ), в зависимости от ориентации разреза в GATC-сайте, наносит второй разрез за пределами mismatch-сайта.

Образовавшаяся брешь, размер которой может достигать 1 т. н., заполняется в результате репарационного синтеза ДНК с помощью ДНК-полимеразы Pol III, а одноцепочечный разрез ликвидируется благодаря ДНК-лигазе.

16.5.1.4. Рекомбинационная репарация

Репарация одноцепочечных повреждений использует матричные свойства интактной комплементарной цепи и является «личным делом» поврежденной молекулы ДНК. В отличие от этого, для репарации двухцепочечных повреждений требуется посторонняя матрица, и в качестве нее используется другая, гомологичная молекула ДНК.

Репарация двухцепочечных повреждений. Хотя повреждения чаще всего затрагивают только одну цепь ДНК, они иногда могут появляться напротив друг друга.

Схема репарации таких двухцепочечных повреждений приведена на рис. 194. Поврежденный дуплекс «выравнивается» со своим интактным гомологом, образуя с ним пресинапс (англ. presynapsis). На решающей стадии репарации дуплексы обмениваются друг с другом гомологичными участками цепей с помощью крестообразных хиазм Холлидея (см. раздел 16.6.1.2). Образовавшийся таким образом синапс (англ. synapsis; от греч. synapos — вместе) расцепляется за счет нанесения симметричных одноцепочечных разрезов и воссоединения их концов. На стадии постсинапса (англ. postsynapsis) формируются два гетеродуплекса, каждый из которых несет одноцепочечное повреждение. И, наконец, повреждения устраняются с помощью соответствующих репарационных систем.

Рис. 194. Репарация двухцепочечных повреждений ДНК. I — пресинапс, молекула ДНК с двухцепочечным повреждением (А) и ее интактный гомолог (Б); II — синапс, гомологичное спаривание с образованием двух хиазм Холлидея; III — постсинапс, нанесение симметричных одноцепочечных разрезов и обмен гомологичными участками ДНК; IV — ликвидация одноцепочечных повреждений с помощью эксцизионной репарации. Аб(n), Ба(n) — гетеродуплексы с повреждением в одной из цепей; Аб(р), Ба(р) — репарированные гетеродуплексы. Толстые линии — старые цепи ДНК; тонкие линии — новые (дочерние) цепи ДНК.

Повторим, что данная стратегия репарации состоит в «размене» двухцепочечного повреждения на пару одноцепочечных повреждений.

Механизмы двухцепочечных повреждений. Существуют два основных механизма двухцепочечных повреждений ДНК.

В первом случае (рис. 195 А, 1-3) двухцепочечные повреждения возникают в процессе репликации. Например, как только репликационная вилка доходит до некодирующего повреждения в одной из цепей ДНК, в частности сайта без основания или пиримидинового димера, действие репликативной ДНК-полимеразы Pol III (см. раздел 16.4.1.1) полностью блокируется. Затем правее повреждения, на среднем расстоянии от него 800 нуклеотидов репликация возобновляется с помощью «склонной к ошибкам» SOS-полимеразы Pol V, которая вскоре уступает место репликативной полимеразе Pol III. Однако при этом в новой, или дочерней цепи появляется незаполнимая брешь (англ. daughter strand gap).

Рис. 195. Образование бреши в дочерней цепи ДНК (А) и двухцепочечного разрыва ДНК (Б) с их рекомбинационной репарацией. 1 — приближение реплисомы к тиминовому димеру; 2 — прекращение репликации интактной цепи; 3 — образование одноцепочечной бреши в поврежденной цепи; 4 — образование хиазм Холлидея; 5 — заполнение одноцепочечной бреши; 6 — демонтаж хиазм Холлидея. 1 — приближение реплисомы к одноцепочечному разрыву; II —распад репликационной вилки и устранение одноцепочечного разрыва в интактной молекуле ДНК; III — создание одноцепочечного «навеса» в поврежденной молекуле ДНК; IV — образование хиазмы Холлидея; V — синаптический синтез ДНК; VI — демонтаж хиазмы Холлидея.

Толстые линии — старые цепи ДНК: тонкие линии — новые (дочерние) цепи ДНК.

Во втором случае (рис. 195 Б, I — III) образуется непреодолимый одноцепочечный разрыв в реплицируемой молекуле ДНК. Достигнув его, репликационная вилка распадается. В результате этого в одной из двух сестринских молекул ДНК появляется свободный конец. Одноцепочечная брешь во второй сестринской молекуле устраняется ДНК-полимеразой PolI, а одноцепочечный разрыв ликвидируется с помощью ДНК-лигазы.

Двухцепочечные повреждения могут непосредственно индуцироваться и внешним воздействием. Например, свободные радикалы, образовавшиеся в водном растворе под воздействием ионизирующей радиации, создают двухцепочечные разрывы в молекуле ДНК, а митомицин С образует с ней поперечные сшивки.

Заметим, что в обоих описанных случаях продуктами рекомбинации являются молекула ДНК с двухцепочечным повреждением и гомологичная ей молекула интактной ДНК.

Два пути рекомбинационной репарации. Двухцепочечные повреждения ДНК репарируются двумя путями, подробно изученными на примере Е. coli. (рис. 195 А, Б). Хотя оба пути зависят от белка RecA, их обозначают как «RecF-путь» и «RecBC-путь» (по названию продуктов генов recF и rесВС).

RecF-путь используется для репарации бреши в дочерней цепи, а RecBC-путь — для репарации двухцепочечного разрыва ДНК. Оба пути включают в себя пресинаптическую, синаптическую и постсинаптическую фазы.

RecF-путь (рис. 195 A, 4 — 6). В данном случае образуются две хиазмы Холлидея.

Гены recFOR индуцируются при SOS-ответе (см. раздел 18.1.2). В пресинаптической фазе гетеротримерный комплекс RecFOR (40, 27 и 22 кДа) перемещается по бреши в дочерней цепи, покрытой SSB-белками, и инициирует образование взаимодействующего с ней филамента белка RecA (см. ниже).

Созданию синапса способствуют две топоизомеразы. Первая из них — это ДНК-топоизомераза IB, или ДНК-гираза; она устраняет положительные супервитки, возникшие при взаимодействии интактного дуплекса с внедренным в него одноцепочечным участком. Вторая — это топоизомераза IA; она устраняет отрицательные супервитки, возникшие в гетеродуплексе.

Брешь в дочерней цепи ликвидируется с помощью ДНК-полимеразы Pol I и ДНК-лигазы.

В постсинаптической фазе резольвасома RuvABC (см. ниже) демонтирует хиазмы Холлидея и филаменты белка RecA. В результате образуется интактный гетеродуплекс и гетеродуплекс с одноцепочечным повреждением, которое устраняется за счет эксцизионной репарации.

RecBC-путь (рис. 195 Б, IV — VI). В данном случае образуется только одна хиазма Холлидея.

На хромосоме Е. coli гены гесВС образуют дицистронный оперон. Ген recD обладает собственным промотором и терминатором (см. раздел 16.3.1.2). Ни один из этих трех генов не индуцируется при SOS-ответе.

Белки RecB (134 кДа), RecC (129 кДа) и RecD (67 кДа) образуют гетеротример. Он обладает тремя ферментативными активностями — геликазной, эндонуклеазной и АТФазной (это единственная известная АТФ-зависимая эндонуклеаза). Задача комплекса RecBCD заключается в том, чтобы сформировать в участке разрыва одноцепочечный выступ, или «навес» (англ. overhang) с 3'-концом, который будет внедрен в интактную молекулу ДНК (рис. 195, Б, IV). Эндонуклеазное расщепление неравномерно затрагивает обе цепи поврежденной молекулы ДНК. По достижении «горячей точки» рекомбинации-повторяющейся Chi-последовательности (см. раздел 16.3.2.1) — расщепление прекращается на 3'-конце бывшей ведущей цепи, однако некоторое время продолжается на 5'-конце бывшей ведомой цепи.

По аналогии с белками RecFOR, белки RecBCD стимулируют образование филаментов белка RecA на одноцепочечных участках ДНК.

После демонтажа хиазмы Холлидея репликационная вилка восстанавливается. Для этого в бреши осуществляется ограниченный синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы Pol I; в «верхнем» разрыве для этого требуются фрагменты Оказаки.

SOS-ответ Е. coli на повреждение ДНК. Часто возникающие одноцепочечные повреждения ДНК, а также более редкие двухцепочечные повреждения репарируются с помощью вышеописанных конститутивных систем. Но когда нарушения носят массовый характер, появляется необходимость в короткий срок резко усилить репарационные процессы.

Соответствующий клеточный механизм называется SOS-ответом (англ. SOS response; см. раздел 18.1.2). Заметим, что это образное название искажает истинную физиологическую ситуацию, поскольку вместо попытки любой ценой остаться в живых клетка запускает рациональную систему адаптивных реакций в ответ на прекращение репликации ДНК.

Итак, на нарушение ДНК, подавляющее ее репликацию, клетка реагирует SOS- ответом. Он выражается в повышенной экспрессии ~20 генов SOS-регулона, продукты которых способствуют возобновлению репликации (табл. 23). Стратегическая задача SOS-ответа состоит в том, чтобы позволить клетке противостоять повреждениям ДНК и, по возможности, произвести их репарацию.

Существуют несколько тактических способов решения данной задачи:

— репликативный аппарат приобретает дополнительную способность преодолевать сайты с отсутствующим основанием благодаря увеличению числа копий ДНК- полимеразы Pol II;

— с целью прохождения участков, блокирующих репликативные полимеразы, повышается экспрессия «склонной к ошибкам» ДНК-полимеразы Pol V;

— возрастает способность к эксцизионной репарации за счет дополнительного синтеза большого количества копий эндонуклеазы UvrABC и геликазы UvrD;

— значительно усиливается рекомбинационная репарация благодаря сверхсинтезу белков RecA и RecN.

На более поздней стадии SOS-ответа усиливается синтез белка SulA, ингибирующего клеточное деление (см. раздел 17.4.1), что предоставляет клетке отсрочку для завершения рекомбинационной репарации.

В тех случаях, когда все принятые меры оказались бесполезными, и возобновить репликацию ДНК так и не удалось, активируются лизогенные профаги, а также колициногенные плазмиды, что приводит к разрушению клетки. Тем не менее, столь неблагоприятный исход выгоден для популяции в целом, поскольку «обреченная» клетка перестает расходовать лимитированные трофические ресурсы на бесполезное поддержание своей жизнедеятельности.

Описанные события происходят в результате поэтапной индукции SOS-генов (табл. 23).

Таблица 23. Гены и их продукты, участвующие в SOS-ответе E. coli

Ген

Функция продукта

Уровень экспрессии (копии на клетку)

Базовый Индуцированный

Первый эшелон

lехА

Репрессор SOS-регулона

1300

1

uvrA //uvrB

Эксцизионная репарация (выявитель сайта// экзонуклеаза)

20/250

250/100

uvrD

Эксцизионная репарация (геликаза)

5000-8000

25000-65000

polB

Репликация «поверх повреждения» (ДНК- полимераза Pol II)

40

300

Второй эшелон

ruvA //ruvB

Рекомбинационная репарация (выявитель сайта/ / геликаза)

700/5600

200/1600

dinl

Ингибитор процессинга белка ЬтпшО

500

2300

recA//recN

Рекомбинационная репарация (дерепрессор SOS-регулона, фактор пресинапса//-*

1000-10000/-

100000/-

Третий эшелон

sulA

Ингибитор цитокинеза

-

-

umuDC

Репликация «поверх повреждения» (ДНК- полимераза Pol V)

180/0

2400/200

Апоптоз

Caa

Колицин А

-

-

Cea

Колицин Е1

-

-

* — данные отсутствуют.

В первом эшелоне индуцируются гены, ответственные за репарацию одноцепочечных повреждений ДНК (uvrABCD) или за их игнорирование (polB).

Когда это не помогает восстановить репликацию, индуцируются гены второго эшелона, в частности recAN, отвечающие за рекомбинационную репарацию.

Если не помогает и это, включаются гены третьего эшелона (umuCD и sulA).

Когда репликация возвращается к норме, все три группы генов репрессируются в обратном порядке. Альтернативой становится апоптоз и лизис клетки.

Повышение уровня экспрессии SOS-генов при прекращении репликации вызвано тем, что репрессор LexA инактивируется под воздействием белка RecA в активной форме (см. рис. 251).

В отсутствии экологических стрессов, приводящих к повреждению ДНК, белок- репрессор LexA подавляет экспрессию SOS-генов — его димеры связываются с квази-палиндромной последовательностью 5'-TACTG(TA)5 CAGTA-3' в промоторных участках SOS-генов, или с SOS-боксом (англ. SOS box), что препятствует инициации транскрипции. Тем не менее, SOS-гены экспрессируются и на низком конститутивном уровне, поскольку белок LexA неэффективно распознает свою мишень, а также из-за того, что транскрипция происходит с альтернативных промоторов.

Роль белка RecA. Как уже отмечалось, при рекомбинационной репарации идет обмен гомологичными одноцепочечными участками между поврежденной и интактной ДНК. В случае Е. coli две сопряженные задачи -- обеспечение контакта гомологов и обмен цепями между ними — решаются с помощью многофункционального фермента RecA (см. раздел 16.6.1.2).

Ген rесА обладает собственными промотором и терминатором и контактирует с генами, которые не имеют отношения к процессам репликации и транскрипции. В обычных условиях белок RecA синтезируется в числе 100-10000 копий на клетку, однако при блокировании репликации из-за повреждения ДНК его количество увеличивается более, чем на порядок (см. табл. 23).

Когда при SOS-ответе Е. coli реагирует на повреждение ДНК, белок RecA переходит в активную форму (RecA*). Она играет роль копротеазы при автопротеолитическом расщеплении репрессора SOS-ответа — белка LexA.

В белке RecA присутствуют два сайта связывания — один для поврежденной одиночной цепи ДНК, другой для интактной ДНК. Его молекулы образуют гексамеры,

наподобие гексамеров геликазы DnaB (см. раздел 16.4.1.1). Гексамеры, в свою очередь, образуют филамент вокруг поврежденной одиночной цепи ДНК, чему способствуют SSB-белки.

Филамент белка RecA «выравнивает» гомологичную последовательность в двух молекулах ДНК и катализирует обмен цепями между ними с образованием хиазм Холлидея (см. рис. 195, А 3-5 и рис. 195, Б III-V). Необходимым условием этой реакции служит гидролиз АТФ, причем в роли АТФазы выступает все тот же белок RecA.

Демонтаж хиазм Холлидея. Хиазмы Холлидея представляют собой локусы, в которых пересекаются одиночные цепи ДНК. Как уже отмечалось, при репарации бреши в дочерней цепи (RecF-путь) образуются две хиазмы Холлидея, а при репарации двухцепочечного разрыва ДНК (RecBC-путь) только одна. Чтобы завершить процесс рекомбинационной репарации, необходимо демонтировать хиазмы Холлидея и филаменты белка RecA. Для этой цели в RecBC-пути используется ферментная система RuvABC (см. также раздел 16.6.1.2).

Генный локус ruv (сокр. англ. repair of ultraviolet damage) индуцируется в первом эшелоне SOS-ответа. Гены ruv АВ входят в индуцибельный оперон; прилегающий к нему ген ruvCобразует моноцистронный оперон.

Белки RuvABC функционально объединяются в резольвасому (см. раздел 16.6.1.2). Белок RuvA образует тетрамеры; его роль сводится к распознаванию хиазм Холлидея и связыванию с ними. Второй белок, RuvB объединяется в гексамеры, нанизанные на дуплекс ДНК, и действует в качестве геликазы. Третий белок, RuvC, активный в димерной форме, играет роль резольвазы. Он наносит разрезы в двух цепях ДНК одинаковой полярности, на одинаковом расстоянии от хиазмы Холлидея, а затем соединяет образовавшиеся концы.

Итак, мы познакомились с разными, порой довольно сложными механизмами репарации. С их помощью устраняются эндогенные и экзогенные повреждения ДНК. Благодаря репарации, а также за счет репликативных ДНК-полимераз, способных к автокоррекции, прокариоты обеспечивают консерватизм своего генома.

Существует еще один защитный механизм, при помощи которого прокариотные геномы защищаются от изменений. Речь идет о системе рестрикции-модификации.

16.5.2. Рестрикция и модификация

Смысл рестрикции заключается в обезвреживании чужеродной ДНК путем ее ферментативного расщепления; смысл модификации — сделать свою ДНК устойчивой против воздействия эндогенных ферментов рестрикции.

Феномен рестрикции (англ. restrict — ограничивать) открыли в 1952 г. американские генетики Луриа (S.E. Luria) и Хьюмен (М. L. Human). В их опытах некоторые штаммы бактерий в значительной степени, хотя и не полностью, ограничивали репродукцию бактериофагов, свободно размножавшихся на других штаммах. Спустя десятилетие Эрбер (W. Arber; Нобелевская премия по физиологии и медицине, 1978 г.) выяснил, что в основе рестрикции лежит фрагментация вирусной ДНК под воздействием сайтспецифичных эндонуклеаз клетки-хозяина. Одновременно с этим было установлено, что рестрикция не является неизбежной; устойчивость к ней можно приобрести в результате модификации (англ. modification) — специфического метилирования нуклеотидов ДНК, находящихся в сайтах рестрикции.

Ферменты рестрикции подавляют репродукцию бактериофагов с немодифицированной ДНК; напротив, при отсутствии этих ферментов или при наличии собственной системы модификации фаги свободно размножаются. Модификация, приобретенная от хозяина, не наследуется и сохраняется только при репродукции фага на штаммах бактерий с полноценной системой рестрикции- модификации.

Системы рестрикции — модификации (англ. Restriction — modification; R — М) представляют собой бифункциональные комплексы, проявляющие «противоположно направленные» ферментативные активности. Одна из этих активностей — эндо- ДНКазная, или рестриктазная, другая — ДНК-метилазная (точнее — ДНК-метилтрансферазная).

Субстратом рестриктазы (англ. restrictase) служит чужеродная ДНК, которая расщепляется на крупные фрагменты. Субстратом метилазы (англ. methylase) является хозяйская ДНК, которая в результате модификации становится устойчивой к воздействию собственных рестриктаз.

Ферменты в составе конкретной системы рестрикции-модификации обладают одинаковой сайт-специфичностью, т. е. распознают один и тот же участок в двухцепочечной, реже — в одноцепочечной молекуле ДНК. Процесс распознавания вызывает конформациоиные изменения и ферментов, и ДНК, что активизирует каталитические центры.

Сайты распознавания обычно имеют длину 4-8 п. н.; они могут быть сплошными или прерывистыми, симметричными или асимметричными, уникальными или вырожденными.

Обе активности — рестриктазную и метилазную — может проявлять один и тот же бифункциональный мультисубъединичный фермент. Однако чаще всего это два разных фермента.

Интересно, что парные, или «родственные» (англ. cognate) рестриктазы и метилазы не гомологичны друг другу. Более того, эндонуклеазы одного и того же типа и даже рестриктазы-изошизомеры (см. ниже) зачастую не являются взаимными гомологами. Метилазы, напротив, взаимно гомологичны.

Рестриктазы (общие сведения). Рестриктаза наносит двухцепочечные разрезы ДНК. Однако это не происходит, если отдельные нуклеотиды в сайте узнавания предварительно подвергаются пострепликативной модификации путем метилирования под действием метилтрансферазы.

В клетках, обладающих R — М системой, ДНК специфически модифицирована по сайтам узнавания собственных рестриктаз, что предотвращает ее «самоубийственное» эндонуклеазное расщепление. Зато чужеродная двухцепочечная немодифицированная ДНК (принадлежащая конъюгативной плазмиде или бактериофагу) легко становится субстратом рестрикции, если она не метилирована. В то же время R — М системы, как правило, не воздействуют при генетической трансформации на экзогенную ДНК, которая переходит из двухцепочечной формы в одноцепочечную и в таком виде может взаимодействовать с хозяйской хромосомой (см. раздел 16.6.1.3).

Рестрикционная эндо-ДНКаза наносит только один двухцепочечный разрез, так что в каждой цепи сайта рестрикции без затраты энергии гидролизуется по одной сахарофосфатной связи. Разрез производится с образованием концевых 5'-фосфатных и 3'-ОН групп. Сайт рестрикции находится либо внутри сайта узнавания, либо близко от него. Гораздо реже они взаимно дистанцированы; при этом положение сайта рестрикции строго не задано.

Кофактором всех известных в настоящее время рестриктаз является Mg2+ или другой двухвалентный катион; дополнительными кофакторами (не путать с расходуемыми субстратами) могут служить АТФ и S-аденозил-L-метионин.

Метилазы (общие сведения). «Модифицирующая» ДНК-метилтрансфераза присоединяет метильную группу к двум одинаковым нуклеотидам, расположенным в комплементарных цепях ДНК внутри сайта узнавания.

Универсальным донором метильной группы служит S-аденозил-Ь-метионин (англ. S-adenosyl-L-methionine; SAM), который превращается в S-аденозил-L-гомоцистеин (англ. S-adenosyl-L-homocysteine; SAH) (рис. 196, А). Помимо функции субстрата он служит аллостерическим эффектором при связывании с сайтом узнавания как метилаз, так и рестриктаз типов I или III (см. ниже).

Рис. 196. Метилтрансферазная реакция (А) и позиции метилирования в азотистых основаниях ДНК (Б). SAM — S-аденозил-L-метионин; SAH — S-аденозил-L-гомоцистеин; R — акцептор метильной группы (остаток аденина или цитозина).

Мишенью для метилаз являются остатки аденина и цитозина, которые преобразуются, соответственно, в N6-метиладенин и N4-метилцитозин или 5-метилцитозин (рис. 196, Б). Метилазы типов I и III метилируют только аденин с образованием N6-метиладенина, в то время как метилазы типов II и IIS могут метилировать цитозин с образованием N4-метилцитозина или 5-метилцитозина, а также аденин с образованием N6-метиладенина.

Предпочтительное образование N4-метилцитозина рассматривается в качестве молекулярной адаптации к термофилии, поскольку 5-метилцитозин даже в мезофильных условиях служит «горячей» точкой спонтанного мутирования. В результате реакции дезаминирования 5-метилцитозина, которая резко ускоряется с повышением температуры, образуется тимин, что при репликации приводит к замене GC-пары на АТ-пару.

В случае, если дезаминируется N4-метилцитозин, образуется уридин. Такая ошибка исправляется системой эксцизионной репарации. Вначале урацил-гликозилаза удаляет остаток урацила. Апуриновый сайт специфически узнается АР-эндонуклеазой с образованием 5'-одноцепочечного разрыва. Довершают дело (5' —>3') —экзонуклеаза III, ДНК-полимераза Pol I и ДНК-лигаза (см. раздел 16.5.1.2).

Метилирование не мешает каноническому спариванию азотистых оснований. В то же время метильные группы размещаются в большой борозде двойной спирали, что делает их легко доступными для белков, взаимодействующих с ДНК.

Метилирование нарушает стерическое соответствие между рестриктазой и сахарофосфатным скелетом ДНК, препятствуя работе этого фермента.

Таким образом, хотя метилированные основания можно формально рассматривать в качестве дополнительной 5-й, 6-й и 7-й букв генетического алфавита, паттерн метилирования не закодирован с помощью триплетов ДНК. Иными словами, в данном случае мы сталкиваемся с одним из примеров эпигенетического наследования (см. раздел 16.8).

У эукариотов метилирование остатков цитозина в дуплетах GC выполняет уникальную роль — распределение метильных групп вдоль цепи ДНК служит основным средством контроля экспрессии генов.

У прокариотов метилирование остатков аденина с помощью метилтрансферазы Dam выполняет другую уникальную функцию — оно обеспечивает распознавание своей и чужой ДНК.

Помимо этого, с Dam-метилированием связаны разнообразные функции, не имеющие отношения к защите от рестрикции. К их числу относятся:

— контроль инициации репликации;

— пострепликативная mismatch-репарация;

— регуляция экспрессии генов;

— транспозиция мобильных элементов;

— контроль упаковки фаговой ДНК.

Контроль инициации репликации. Метилтрансфераза Dam выполняет исключительно важную роль в координировании репликации ДНК с клеточным циклом бактерий (см. разделы 16.4.1.1 и 17.1.2). Реакция, которую катализирует этот фермент, служит редким, хотя и не единственным примером регуляторного метилирования у прокариотов; еще один пример связан с метилтрансферазой CheR, участником регуляторной системы хемотаксиса (см. раздел 18.4.1.1).

Метилтрансфераза Dam типа II, не входящая в тандем с рестриктазой, и которую образно называют «одинокой» (англ. solitary) или «сиротой» (orphan), метилирует по 6-му положению остатки аденина в повторяющейся последовательности GATC. На протяжении клеточного цикла степень метилирования ДНК изменяется очень сильно — от полуметилирования сразу после завершения репликации, когда метилирована только одна цепь, до полного метилирования обеих цепей (>99% сайтов GATC еще через 2-3 с). Единственным участком ДНК, который остается полуметилиро- ванным в течение ~20 мин, является локус oriC (см. раздел 16.4.1.1).

Регуляторный эффект метилирования выражается в том, что локусы oriC и dnaA координированно и обратимо переходят от полуметилированного (неактивного) к полностью метилированному (активному) состоянию. Когда активны оба хромосомных локуса, ген dnaA активно транскрибируется, что позволяет его продукту инициировать репликацию в локусе oriC. После завершения раунда репликации локусы oriC и dnaA, расположенные на дистанции <50 т. п. н. друг от друга, почти одновременно переходят в полуметилированное состояние и инактивируются. Локус oriC образует тройственный комплекс с белком SeqA и клеточной оболочкой. Изолированный от реплисомы ориджин не может приступить к новому раунду репликации даже при высоком содержании белка DnaA.

Аналогичный контроль репликации путем Dam-метилирования осуществляется в случае плазмид и профагов, когда те и другие реплицируются с помощью тета-механизма (см. раздел 16.4.1.2).

Наконец, особая система метилирования ДНК существует у Caulobacter crescentus и ряда других протеобактерий. В данном случае метилтрансфераза СсrМ модифицирует остатки аденина в

повторяющейся последовательности GANTC (где N — один из четырех нуклеотидов). Полагают, что такая система выступает в роли регулятора диморфного клеточного цикла (см. раздел 17.1).

Пострепликативная mismatch-репарация. Эта репарационная система предназначена для устранения ошибок репликации, по тем или иным причинам не исправленных автокорректирующей ДНК-полимеразой Pol III. К данной теме мы уже обращались в разделах 16.4.1 и 16.5.1.2.

Регуляция экспрессии генов. Напомним, что для прокариотов контроль экспрессии генов путем метилирования в целом не характерен. Два самых известных примера — это ген dnaA и ген транспозазы инсерционной последовательности IS 10 (см. ниже).

Приведем еще два примера Darn-зависимой экспрессии; они касаются генов mom и рар. Ген mom (сокр. англ. modification in Mu) отвечает за специфическую модификацию путем превращения аденина в ацетамид-аденин, благодаря чему ДНК бактериофага Мu приобретает устойчивость к хозяйской рестрикции. В свою очередь, ген рар (сокр. англ. pyelonephritis associated pili), имеющийся у уропатогенных штаммов Е. coli, отвечает за образование Рар-фимбрий II типа (см. I том учебника). «Фазовая» осцилляция Рар-фимбрий происходит между состоянием экспрессии (англ. phase on) и отсутствием экспрессии (англ. phase off). Оперон рарВА содержит сайты GATC1028 и GАТС1130, уровень метилирования которых коррелирует с фазовым состоянием. В состоянии phase off сайт GATC1028 метилирован полностью, а сайт GATC1130 полностью неметилирован; обратная картина наблюдается в состоянии phase on. На изменение уровня метилирования этих сайтов влияет продукт гена papl, являющийся позитивным регулятором транскрипции гена пилила (подробнее см. раздел 16.8).

Транспозиция мобильных элементов. Путем Dam-метилирования регулируется транспозиция некоторых мобильных элементов (см. раздел 16.3.1.3), в том числе составного транспозона Тn10. обеспечивающего устойчивость к тетрациклину. Он содержит инвертированные инсерционные последовательности IS10, причем только правая из них кодирует активную транспозазу. Внутри этой последовательности находятся два сайта GАТС - один в промоторном участке транспозазы, другой во внутреннем инвертированном концевом повторе; метилирование влияет на активность обоих локусов. В чем биологический смысл этого явления?

Как выяснилось, активность гена транспозазы возрастает в полуметилированном состоянии — степень метилирования сайта GATC непосредственно определяет сродство промотора к РНК-полимеразе. Кроме того, транспозиции чаще подвергается IS10, метилированная на кодирующей (ведущей) цепи. А поскольку после прохождения репликационной вилки метилирование сохраняется именно в этой цепи, клетка получает как минимум одну копию локуса, способного к транспозиции.

Контроль упаковки фаговой ДНК. Упаковке ДНК бактериофага Р1 предшествует разъединение копкатемеров (англ. concatemer; от лат. concatenatus — образующий цепочку и греч. meros — часть), или вирусных геномов, ковалентно связанных друг с другом. От сайта расщепления конкатемера в локусе рас (~160 п. н.) начинается однонаправленная упаковка ДНК в прокапсид. Поскольку количество инкапсидированной ДНК превышает размер генома на 10-15%, ее молекулы содержат одинаковые последовательности на обоих концах. Благодаря такой концевой «избыточности» фаговая ДНК способна переходить в кольцевую форму, что способствует ее рекомбинации с ДНК хозяина. Расщепление каждого конкатемера по локусу рас привело бы к образованию одиночных геномных эквивалентов, лишенных концевой избыточности. Поэтому должен существовать механизм, который контролировал бы выбор локуса рас, маркирующего начало упаковки фаговой ДНК.

Установлено, что каждый локус рас содержит семь сайтов GATC, которые могут метилироваться с помощью фаговой Dam-метилазы. При репликации образуются устойчивые к расщеплению неметилированные и полуметилированные локусы рас, а также чувствительные к расщеплению метиллированные локусы рас, маркирующие начало упаковки фаговой ДНК. Полному метилированию неметилированных и полуметилированных локусов рас препятствует связывающийся с ними хозяйский или фаговый белок «паказа» (англ. pacase; от pack — упаковывать). Таким образом, выбор локуса рас, маркирующего начало упаковки фаговой ДНК, определяется балансом между метилированием и связыванием паказы, в результате чего на один функциональный локус рас приходятся 3-5 нефункциональных.

Как мы уже отмечали, метилированию подвергаются нуклеотиды в обеих комплементарных цепях ДНК. Однако для появления устойчивости к рестриктазе достаточно, чтобы оно произошло только в одной цепи. Физиологический смысл устойчивости такой полуметилированной ДНК к эндонуклеазному расщеплению очевиден, поскольку новые цепи, образующиеся в ходе репликации, вначале не метилируются (см. раздел 16.4.1.1).

R — M системы. Распространение R — М систем ограничено миром прокариотов, главным образом бактериями. Аналогичные системы открыты у архей (например, Mwol — система типа II Methanobacterium wolfei), хотя они более редки и изучены хуже, чем у бактерий. «Автометилирующие» метилтрансферазы типа II (см. ниже) закодированы в геномах ряда вирулентных и умеренных бактериофагов, а также в виде исключения имеются у вирулентных вирусов Chlorella sp. Но даже в случае бактерий они выявлены только у 25% изученных штаммов, что может тривиально объясняться упущениями при анализе. Зато половина из них обладает сразу несколькими R — М системами.

Селективная выгода, которую придают бактериям разные R — М системы, обуславливает их широкое распространение и исключительное разнообразие (>3 тыс. вариантов).

В настоящее время описаны несколько типов R — M систем, которые выполняют одну и ту же биологическую функцию, хотя разными способами. Их особенности касаются субъединичного состава, используемых кофакторов, а также структуры сайта узнавания и местоположения сайта рестрикции (табл. 24).

Таблица 24. Свойства бактериальных R — М систем

Тип системы

Соотношение реакций рестрикции и модификации; состав ферментов

Сайт узнавания

Положение сайта рестрикции

Кофакторы реакциирестрикции

I

Альтернативные реакции; осуществляются бифункциональным ферментом, состоящим из трех субъединиц

Специфические последовательности длиной 3 и 4 п. н., разделенные неспецифическим спейсером длиной 6-8 п. н.

На большом расстоянии (>1 т. п. н.) от сайта узнавания

Mg2+, АТФ, SAM*

II и IIS

Параллельно протекающие реакции; осуществляются разными ферментами; рестриктаза состоит из двух субъединиц (тип II) или из одной субъединицы (тип IIS), метилтрансфераза из одной субъединицы

Специфическая последовательность длиной 4-8 п. н. (в большинстве случаев палиндром)

Совпадает с сайтом узнавания (тип II) или находится по одну сторону от него, на расстоянии 1-20 п. н. (тип IIS)

Mg2+

III

Параллельные реакции; осуществляются бифункциональным ферментом из двух субъединиц

Специфическая асимметричная последовательность длиной 5- 6 п. н.

На расстоянии 24- 26 п. н. от 3'-конца сайта узнавания

Mg2+ , АТФ, SAM

* — S-аденозил-L-метионин.

Для обозначения R — М систем используются 3-х буквенные сокращения имени их обладателя; первая буква обозначает род, вторая и третья вид; иногда за ними следует индекс штамма, а римская цифра указывает на тип системы (например, EcoRII — это R — М система Е. coli штамма R, тип II).

Гены, кодирующие компоненты R—М систем, обозначаются либо как hsd (сокр. англ. host-specifity of DNA), либо по конкретной субъединице, например, mod (сокр. англ. modification). Они входят в состав хромосомного генома (например, в случае системы EcoА), плазмидного генома (например, в случае системы EcoRI) или вирусного генома (например, в случае системы EcoP1) и чаще всего тесно сцеплены друг с другом.

R — M системы типа I. Системы данного типа имеются у энтеробактерий Е. coli, Citrobacter spp. и Salmonella spp. Они наиболее сложны и состоят из трех субъединиц: R (135 кДа; ген hsdR) — рестрицирующей; М (62 кДа; ген hsdM) — модифицирующей и S (55 кДа; ген hsdS) —обеспечивающей специфическое распознавание сайта метилирования. Комплекс субъединиц, представленных в разном стехиометрическом соотношении (например, 2:2:1 в случае ЕсоК), является мультифункциональным ферментом — он играет роль рестриктазы, метилазы, АТФазы и ДНК-топоизомеразы.

В присутствии SAM субъединица R связывается с сайтом узнавания независимо от того, метилирован он или нет. Если сайт узнавания был полностью метилирован, голофермент диссоциирует от ДНК, если полуметилирован — субъединица М метилирует вторую цепь, если вообще не метилирован — голофермент выступает в роли топоизомеразы и, благодаря принудительному изгибу ДНК, наносит разрез в вариабельном положении на значительном удалении от сайта узнавания. Первые две реакции стимулируются связыванием АТФ, а третья использует энергию гидролиза АТФ.

R — М системы типа II. Это самые распространенные системы — их открыто около 3 тыс, с учетом всех изошизомеров (англ. isoschizomer; от греч. isos — равный, schizo — раскалывать и meros — часть; в данном случае — рестриктазы разных объектов, разрезающие в одинаковом месте один и тот же вариант последовательности; например, для рестриктаз BamHI и Рае 1771 это последовательность G↑GATCC). Они проще других, поскольку два фермента по отдельности катализируют рестриктазную и метилазную реакции.

Главный признак системы типа II — это то, что рестриктаза наносит разрез в пределах сайта узнавания или близко к нему; кроме того, для нуклеолитической реакции не требуется гидролиз АТФ. Рестриктаза представляет собой гомодимер субъединиц молекулярной массой ~30 кДа.

Сайт узнавания обычно палиндромный, со сплошной структурой, например, GAATTC, или с прерывистой структурой, например, GANTC или CCANgTGG (где N — один из четырех нуклеотидов). Встречаются уникальные сайты узнавания, например, GTCGAC, и вырожденные сайты, например, GTYRAC (где Y — цитозин или тимин и R — аденин или гуанин).

Рестриктазы типа II наносят разрез внутри комплементарных последовательностей сайта узнавания; каноническим примером служит рестриктаза Escherichia coli R EcoRl:

5'G ↓ AATT-C

C-TTAA ↑ G5'.

Поскольку сайт рестрикции представляет собой палиндром, в двухцепочечной ДНК делаются симметричные разрезы с образованием коротких одноцепочечных липких концов (в приведенном примере это AATT). Такое замечательное свойство продуктов рестрикции широко используется в молекулярной биологии при конструировании гибридных ДНК (см. раздел 16.1.2.3).

Систем подтипа IIS насчитывается на порядок меньше, чем типа II. Они распознают асимметричную сплошную последовательность длиной 4-7 п. н. и наносят разрез по одну сторону от сайта узнавания, обычно на фиксированном расстоянии в 1-20 п. н. от него. Примером служит рестриктаза Flavobacterium okeanokoites Fok I:

5'GGATGNNNNNNNNN ↓ NNNN-NN ...

CCTACNNNNNNNNN-NNNN T ↑ NN... 5'.

Иными словами, рестриктазы подтипа IIS содержат домен, отвечающий за распознавание сайга узнавания, и домен, отвечающий за распознавание сайта рестрикции (в этом отношении они сходны с рестриктазами класса III; см. ниже).

В отличие от канонических R—М систем типа II, 5'-3' последовательности в комплементарных цепях сайта узнавания различаются (в приведенном примере это GGATG и САТСС), т. е. он имеет асимметричную структуру.

Наконец, в отличие от димерных рестриктаз типа II, рестриктазы подтипа IIS представляют собой мономеры молекулярной массой 50-110 к Да.

Помимо канонической системы типа II и системы подтипа IIS, в настоящее время описаны системы подтипов IIВ, IIЕ, IIF, IIG, ИМ и IIТ. Они имеют разный субъединичный состав и различаются по количеству, а также но местоположению сайтов рестрикции.

R — М системы типа III. Данные системы встречаются гораздо реже остальных. Они обнаружены только в четырех случаях — у профага PI (EcoP1), у плазмиды Р15 Е. coli (ЕсоР15). у Haemophilus influenzae серотип f (HinfIll) и у Salmonella entérica штамм LT (StyLTI). Все они состоят из двух субъединиц: R (~110 кДа; ген hsdR или res) — рестрицирующей и MS (~75 кДа; ген hsdMS или mod) —с двойной функцией узнавания и модифицирования.

Уникальным свойством данных систем является то, что при модификации метилируется только одна цепь ДНК. Но поскольку при репликации метилирование сохраняется только в одной сестринской молекуле ДНК, встает вопрос, что позволяет другой, полностью неметилированной молекуле ДНК избежать рестрикции?

Есть предположение, что в данном случае для рестрикции требуются два модифицированных сайта противоположной ориентации. В свою очередь, два сайта прямой ориентации устойчивы к рестрикции, но могут модифицироваться. А поскольку после репликации немодифицированные сайты оказываются в прямой ориентации, они не рестрицируются.

Рестрикция, требующая модификации. До сих пор мы обсуждали только такую рестрикцию, которая блокируется метилированием.

В настоящее время установлено, что рестрикционные системы подразделяются на:

— классические R — М системы типов I — III (клеточная ДНК защищается от рестрикции путем модификационного метилирования по остаткам аденина и цитозина, расположенным внутри сайта узнавания);

— неклассические R — М системы (которые расщепляют только специфически модифицированную ДНК).

Примером неклассических R — М систем служат имеющиеся у Е. coli системы МcrА и МсгrВС (сокр. англ. modified cytosine restriction), а также система Мrr (сокр. англ. modified adeninerecognition and restriction). Они кодируются плазмидами и разрезают сайты фаговой ДНК, содержащие 5-метилцитозин, 5-гидроксиметилцитозин, N4-метилцитозин или N6-метиладенин.

Такие системы используют в качестве кофакторов катионы Mg2+, а также ГТФ (в случае МсrВС) и не обладают модифицирующей активностью. Каково же их предназначение?

Скорее всего, неклассические R — М системы служат для целенаправленной борьбы с теми бактериофагами, ДНК которых содержит модифицированные основания. Иными словами, клетке гораздо выгоднее иметь упрощенную систему рестрикции, чем расходовать метаболические ресурсы на биогенез более громоздких классических R — М систем.