ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ - Т.П. Пирог - 2004

19. ГЕНЕТИКА БАКТЕРІЙ: ПОСТІЙНІСТЬ, ЗМІНА ТА ПЕРЕДАВАННЯ ОЗНАК

19.3. ПЕРЕДАВАННЯ ОЗНАК І ГЕНЕТИЧНА РЕКОМБІНАЦІЯ

19.3.7. Загальні принципи клонування генів (конструювання гібридних молекул ДНК in vitro)

Генетична інженерія є відносно новою методичною галуззю молекулярної біології та біотехнології. Об’єднання на початку 70-х років XX ст. незалежно розроблених методів дало можливість створити сучасну стратегію генетичної інженерії, суть якої полягає ось у чому: 1) у молекулу ДНК, здатну реплікуватися в клітині автономно від хромосоми (плазміда або вірусна ДНК), in vitro (у пробірці) ферментативно вбудовують фрагменти ДНК з будь-якого джерела; 2) одержані гібридні молекули вводять у чутливі клітини; 3) у клітинах гібридні молекули ДНК реплікуються, розмножуючи у своєму складі клонований фрагмент ДНК; 4) певними методами селекціонують клони клітин або вірусів, які містять індивідуальні молекули гібридних ДНК; 5) виявлені гібридні ДНК піддають різнобічному структурно- функціональному вивченню.

Найпростішим і найпопулярнішим методом отримання гібридних молекул ДНК є рестрикціозно-лігазний метод (рис. 19.3).

Перші гібридні молекули були одержані таким методом у 1973 р. американцями С.Н. Коеном та Г.В. Бойєром. Гібридні молекули називаються також рскомбінантними.

Рис. 19.3. Одержання гібридної ДНК введенням сукаріотичної ДНК у бактеріальну плазміду (спрощена схема)

Плазміда розрізається однією з рестриктаз, здатних утворювати у фрагмента ДНК одноланцюгові “липкі” (тобто комплементарні) кінні Такою рестриктазою є, наприклад, рестриктаза EcoRI. Цією ж рестриктазою розрізається на фрагменти ДНК, в якій міститься ген, що цікавить дослідника. Якщо змішати ці фрагменти ДНК з розрізаною плазмідою, то з певною вірогідністю вони з’єднаються завдяки “липким” кінцям. Далі сторонню ДНК ковалентно пришивають до олазміди (вектора) за допомогою ферменте ДНК-лігази. Гібридну (рекомбінантну) молекулу ДНК шляхом трансформації вводять у клітину, де вона реплікується разом з плазмідою. Потомство клітини, яке містить гібридну ДНК, є генетично однорідним — воно утворює клон.

Генна інженерія відкрила небувалі раніше можливості для створення принципово нових продуцентів біологічно активних речовин.