ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 7

ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА БРОЖЕНИЯ МОЛОЧНОГО САХАРА

Цель работы - изучить процесс брожения молочного сахара молочнокислыми микроорганизмами.

Ход работы. Выполняются задания:

Задание 1. Ознакомиться с видами брожения молочного сахара.

Задание 2. Изучить процессы ферментативного гидролиза лактозы в молочных продуктах.

Задание 3. Исследовать влияние различных факторов на процесс брожения молочного сахара молочнокислыми микроорганизмами.

Теоретическое обоснование

Брожение - одна из разновидностей биологического окисления субстрата у гетеротрофных микробов с целью получения энергии, когда акцептором электронов или атомов водорода является органическое вещество.

Катаболизм углеводов и продукты брожения

Все типы брожения до образования пировиноградной кислоты идут с получением одних и тех же промежуточных продуктов и по одному и тому же пути - пути Эмбдена-Мейергофа. Дальнейшие превращения пировиноградной кислоты могут идти в разных направлениях, которые будут определяться специфическими особенностями данного микроорганизма и условиями среды. Конечными продуктами брожения могут быть молочная, уксусная, пропионовая, масляная кислоты, спирты, ароматические вещества, диоксид углерода и другие соединения. Всем истинным процессам брожения свойственно общее правило: восстановленная на первой стадии форма НАД (за счет окисления 3-фосфоглицеринового альдегида) снова окисляется на второй стадии, передавая водород любому акцептору. Это может быть пировиноградная кислота, ацетилфосфат, ацетальдегид, диацетил, ацетоин и т. д. Таким образом, наблюдается сопряжение стадий окисления и восстановления с точным соблюдением эквивалентности.

В основе изготовления целого ряда молочных продуктов лежат процессы глубокого распада молочного сахара под действием микроорганизмов, называемые брожением. Молочнокислое брожение является основным процессом при изготовлении заквасок, сыра и кисломолочных продуктов, а молочнокислые бактерии - наиболее важной группой микроорганизмов для молочной промышленности. Существует несколько типов брожения лактозы, различающихся составом конечных продуктов. Конечными продуктами брожения могут быть молочная, пропионовая, уксусная, масляная кислоты.

Начальным этапом всех типов брожения является расщепление молочного сахара на глюкозу и галактозу под влиянием фермента лактазы (b-галактозидазы) (рис. 23).

Рис. 23. Расщепление молочного сахара на глюкозу и галактозу

Далее брожению подвергается глюкоза. Превращение глюкозы в пировиноградную кислоту в результате ряда последовательных реакций происходит при участии 10 ферментов (рис. 24).

Рис. 24. Схема брожения молочного сахара

Галактоза при участии уридиндифосфатглюкозы переходит в глюкозо-1-фосфат, который после изомеризации в глюкозо-6- фосфат включается в схему превращения глюкозы:

В зависимости от того, какие продукты образуются при сбраживании глюкозы (только молочная кислота или также другие органические продукты и СО2), молочнокислые бактерии принято подразделять на гомоферментативные и гетероферментативные (рис. 25).

Рис. 25. Возбудители молочнокислого брожения

Гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически только одну молочную кислоту (она составляет не менее 90 % всех продуктов брожения). Для гомоферментативных бактерий характерным является сбраживание глюкозы по гликолитическому (фруктозодифосфатному) пути Эмбдена-Мейергофа:

С6Н12O6 + 2Фн + 2АДФ ® 2С3Н6O3 +2АТФ + Н2O.

Из 1 моль глюкозы образуется 2 моль молочной кислоты с одновременным синтезом 2 моль АТФ (рис. 26).

Рис. 26. Схема гомоферментативного молочнокислого брожения

Бактерии обладают всеми необходимыми для этого ферментами, включая альдолазу, а водород, отщепляющийся при дегидрировании глицеральдегид-3-фосфата, передается на пируват. От стереоспецифичности лактатдегидрогеназы и от наличия лактатрацемазы зависит, какой продукт образуется – D (-), L (+) или DL-молочная кислота. Лишь небольшая часть пирувата декарбоксилируется, превращаясь в уксусную кислоту, этанол и СО2, а также в ацетоин. Количество образующихся побочных продуктов зависит от доступа кислорода.

Большинство штампов молочнокислых бактерий преимущественно продуцируют L (+) - молочную кислоту. Болгарские палочки L. bulgaricus и лейконостоки - в основном D (-) форму, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus, L. Plantarum – оба изомера в почти одинаковых количествах. Следовательно, соотношение между этими изомерами в кисломолочных продуктах будет зависеть от вида используемых для заквасок молочнокислых бактерий.

Гетероферментативные бактерии около 50 % глюкозы превращают в молочную кислоту, а остальное количество - в этиловый спирт, СН3СООН и СО2. У гетероферментативных молочнокислых бактерий отсутствует ключевой фермент альдолаза и триозофосфатизомераза. Начальное превращение глюкозы идет у них исключительно по пентозофосфатному пути:

С6Н12O6 + Фн + АДФ ® СзН6Оз + С2Н5ОН + СО2 +АТФ.

В ходе реакций по пентозофосфатному пути из каждого моль глюкозы образуется моль молочной кислоты, моль этанола и СO2.

В аэробных условиях возможно образование двух молекул АТФ, тогда ацетилфосфат превращается не в этанол, а в уксусную кислоту. Бифидобактерии сбраживают глюкозу до уксусной и молочной кислот (уксусной в 1,5 раза больше, чем молочной).

Молочнокислое брожение используется в молочной промышленности для изготовления простокваши, творога, сметаны, кефира, сливочного масла, ацидофильного молока и ацидофильной простокваши, сыров, квашеных овощей, при приготовлении хлебных заквасок, молочной кислоты. Молочнокислые бактерии широко применяют также при силосовании кормов, при выделке меховых шкурок и в производстве молочной кислоты.

Большое значение эти бактерии имеют при квашении овощей, силосовании кормов (растительной массы) для животных, в хлебопечении, особенно при изготовления ржаного хлеба. Положительные результаты дают исследования по использованию молочнокислых бактерий при изготовлении некоторых сортов колбас, соленовареных мясных изделий, а также при созревании слабосоленой рыбы для ускорения процесса и придания продуктам новых ценных качеств (вкуса, аромата, консистенции и др.). Промышленное значение имеет также применение молочнокислых бактерий для получения молочной кислоты, которую используют в безалкогольных напитках. Спонтанно (самопроизвольно) возникающее молочнокислое брожение в продуктах (молоке, вине, пиве, безалкогольных напитках и др.) приводит к их порче (прокисанию, помутнению, ослизнению).

Методические указания

Оборудование и материалы: термостат, лактоденсиметр, рефрактометр, цилиндр на 250 см3, пипетки на 5 и 10 см3, колбы на 50-100 см3, бюретки на 25 см3, стаканы на 100 см3, термометр со шкалой 0-100 °С, 1 %-й раствор фенолфталеина, 0,1 н. раствор NaOH, 2,5 %-й водный, закваски, соль поваренная «Экстра».

Возбудителями молочнокислого брожения являются молочнокислые микроорганизмы. Их активность зависит от ряда факторов: температуры, pH, химического состава питательной молочной среды, концентрации сахара, соли, жира, продуктов обмена и ряда других условий.

Для исследований используются следующие закваски:

Закваска № 1. Закваска на чистых культурах мезофильных молочнокислых стрептококков (Lactococcus lactis, Lactococcus cremoris) или закваска для сметаны и творога (Tоптим 30-35 °С).

Закваска № 2. Закваска на чистых культурах термофильных молочнокислых палочек (Lactobacillus acidophilus) (Топтим 40-42 °С).

Закваска № 3. Йогуртовая закваска (Streptococcus thermophilus и Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus оптим 40-45 °С).

Закваска № 4. Кефирная закваска (Топтим 18-22 °С).

Изучение влияния температуры культивирования на процесс брожения молочного сахара

На одном занятии исследуются 2 вида заквасок на выбор. Подготовить образцы обезжиренного молока для исследования. Определить в них показатели: плотность, титруемую кислотность, массовую долю лактозы. В стаканы отмерить по 50 см3 пастеризованного молока, подогретого до температуры в соответствии с табл. 2. В каждый образец внести по 10 см3 исследуемой закваски, тщательно перемешать.

Таблица 2. Постановка опыта и результаты

Закваска

Образец

Температура, °С

Кислотность, °Т

Через 30 мин

Через 1 ч

Закваска № 1

1.1

30

1.2

40

1.3

22

Закваска № 2

2.1

30

2.2

40

2.3

22

Подготовленные образцы поместить в термостат с соответствующей температурой и культивировать в течение 30 мин. Образец с температурой 22-24 °С оставить при условиях окружающей среды в безопасном месте. Культивировать в течение 1 ч.

Через 30 мин от начала культивирования из каждого образца отобрать по 10 см среды для определения титруемой кислотности. Результат занести в таблицу. В конце культивирования определить кислотность образцов, результат занести в таблицу.

Сделать выводы об активности заквасок по нарастанию кислотности в процессе культивирования при разных температурах.

Изучение влияния химического состава питательной среды на процесс брожения молочного сахара

Подготовить образцы питательных сред для исследования в соответствии с табл. 3. Определить в них показатели: плотность,

титруемую кислотность, массовую долю лактозы. Результаты записать.

В стаканы отмерить по 50 см3 каждого образца питательной среды, подогреть до оптимальной температуры культивирования микроорганизмов закваски. Исследуется один вид закваски на выбор. В каждый образец внести по 10 см3 исследуемой закваски, в образцы 3.2 и 3.3 дополнительно внести поваренную соль NaСl, тщательно перемешать.

Таблица 3. Постановка опыта и результаты

Закваска

Образец

Вид среды

Образец

С хлоридом натрия

Кислотность, °Т

Через 30 мин

Через 1 ч

Закваска №

3.1

Обезжиренное молоко

3.1

Контроль

3.2

5 %

3.3

10 %

4

Молоко жирностью 2,5 %

5

Молоко жирностью 3,2 %

6

Молочная сыворотка

Подготовленные образцы поместить в термостат с соответствующей температурой и культивировать в течение 1 ч.

Через 30 мин от начала культивирования из каждого образца отобрать по 10 см3 среды для определения титруемой кислотности. Результат занести в таблицу. В конце культивирования определить кислотность образцов, результат занести в таблицу.

По нарастанию кислотности молока при молочнокислом брожении можно рассчитать, какое количество молочного сахара было сброжено.

Пример расчета

Сначала нужно рассчитать количество образовавшейся молочной кислоты. Молекулярная масса молочной кислоты равна 90. Количество миллилитров 0,1 н. NaОН, потраченное на титрование 100 см3 молока, следует умножить на 0,009, так как 1 см3 0,1 н. NaОН нейтрализует эквивалентное количество молочной кислоты - 0,009 г молочной кислоты. Для расчета необходимо из конечного результата значения кислотности вычесть показатель кислотности исходного молока (сыворотки). Например, начальная кислотность молока перед внесением закваски составляла 16 °Т. По окончании культивирования - 60 °Т. Разница 60-16 = 44. Далее 44 х 0,009 = 0,396. Следовательно, образовалось 0,396 г молочной кислоты.

Из суммарной реакции молочнокислого брожения следует, что из 1 моль молочного сахара образуется 4 моль молочной кислоты. Масса 1 моль молочного сахара С12Н22O11 равна 342 г, т. е. из 342 г молочного сахара образуется 4 х 90 = 360 г молочной кислоты. Следовательно, для получения 0,396 г молочной кислоты потребовалось молочного сахара:

Результаты расчетов записать.

Сделать выводы об активности заквасок при сбраживании молочного сахара по нарастанию кислотности в процессе культивирования в зависимости от состава питательной среды.

Контрольные вопросы

1. Назовите основные типы брожения молочного сахара. Какие факторы влияют на интенсивность брожения?

2. По какому пути идет сбраживание глюкозы при гомоферментативном и гетероферментативном брожении лактозы?

3. Назовите основных возбудителей гомоферментативного и гетероферментативного брожения лактозы.

4. Как используется молочнокислое брожение в пищевой промышленности?

5. Как рассчитать количество сброженного молочного сахара в процессе брожения?

Оформление отчета

Отчет должен содержать:

1. Цель работы.

2. Ход работы и основные результаты исследований.

3. Выводы и расчеты.