БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 1

ЧАСТЬ I. КОНФОРМАЦИЯ И ДИНАМИКА

ГЛАВА 8. АКТИВАЦИЯ ПРОФЕРМЕНТОВ: ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ И ФАКТОРЫ СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ

8.20. Мономеры фибрина спонтанно образуют фибриллы

Растворимость мономеров фибрина значительно ниже растворимости фибриногена. Они спонтанно агрегируют, образуя фибрин, имеющий форму длинных нерастворимых нитей (фибрилл). Методами электронной микроскопии и дифракции рентгеновских лучей, направленных под малым углом, показано, что фибрин обладает периодической структурой с длиной повторяющегося участка 230 А (рис. 8.29). Поскольку длина фибриногена составляет около 460 А, т.е. вдвое больше, представляется вероятным, что мономеры фибрина при агрегации образуют параллельные ряды, сдвинутые относительно друг друга на пол молекулы (рис. 8.30).

Class="center">Рис. 8.29. Электронная микрофотография фибрина. Длина периода структуры по оси волокна составляет 230 А, т.е. половину длины молекулы фибриногена

Рис. 8.30. Предполагаемое расположение мономеров фибрина в фибриновом сгустке. При такой укладке мономеров фибрина, когда параллельные ряды оказываются сдвинутыми относительно друг друга на полмолекулы, длина периода структуры составляет 230 А в соответствии с реально существующей картиной

Чем объяснить, что мономеры фибрина способны агрегировать, а фибриноген, из которого они образуются, нет? Окончательный ответ на этот вопрос дадут проводящиеся детальные исследования структуры молекул. Все изученные к настоящему времени фибринопептиды всех видов позвоночных обладают большим отрицательным зарядом. В них обнаружено обилие остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот. Кроме того, в В- фибринопептиде имеется необычное отрицательно заряженное производное тирозина, а именно Тирозин-О- сульфат. Видимо, наличие этих, а также и других отрицательно заряженных групп вызывает отталкивание молекул фибриногена друг от друга. Высвобожденные тромбином мономеры фибрина обладают поверхностью с совершенно другими электрическими свойствами, обусловливающими способность к агрегации. Вспомним, что замена всего лишь одной заряженной группы - глутамата на валин - является причиной агрегации дезоксигемоглобина при серповидноклеточной анемии.

8.21. Сгусток фибрина стабилизирован ковалентными поперечными связями

Сгусток, образующийся при спонтанной агрегации мономеров фибрина-еще очень слабый и рыхлый. Затем он стабилизируется ковалентными поперечными связями между боковыми цепями отдельных молекул в фибриновых нитях. Установлено, что в ходе реакции трансамидирования пептидные связи образуются между боковыми цепями специфических остатков глутамина и лизина (рис. 8.31). Фермент, катализирующий эту реакцию, трансамидаза. Поперечные связи указанного типа встречаются в белках крайне редко. Значение их видно из того, что у больных с врожденной недостаточностью трансамидазы повышена кровоточивость.

Рис. 8.31. Перекрестные связи в фибрине образуются в результате трансамидирования

8.22. Тромбин гомологичен трипсину

Способность тромбина специфически расщеплять связь между остатками аргинина и глицина свидетельствует, по-видимому, о сходстве тромбина с трипсином. И действительно, такое сходство имеется, что явствует из сопоставления последовательностей остатков аминокислот в этих белках. Тромбин имеет массу 33,7 кДа и состоит из двух цепей. Цепь А из 49 остатков не проявляет заметной гомологии с ферментами поджелудочной железы. Цепь В, напротив, очень сходна с трипсином, химотрипсином и эластазой по последовательности аминокислот. Последовательность аминокислот вокруг серина в активном центре тромбина: Glу-Аsр-Sег-Glу-Сlу-Рго, т.е. такая же, как и в сериновой протеиназе поджелудочной железы. Более того, в тромбине имеется и система переноса заряда. Ее трехмерная структура еще не раскрыта, но установлена одна важная особенность, характеризующая участок специфического связывания: в тромбине, как и в трипсине, на дне кармана, связывающего субстрат, находится остаток аспартата. Эта отрицательно заряженная группа несомненно должна электростатически связывать положительно заряженную боковую цепь аргинина субстрата. Специфичность тромбина значительно выше, чем специфичность трипсина: тромбин расщепляет только определенные связи Аргинин-Глицин, тогда как Трипсин гидролизует почти любую пептидную связь, следующую за остатками аргинина или лизина.

Как и панкреатические Сериновые протеиназы, тромбин синтезируется в виде профермента -протромбина, имеющего мол. массу 66 кДа. В результате протеолитического расщепления связи аргинин—Треонин с аминоконца протромбина высвобождается фрагмент массой 32 кДа (рис. 8.32). Последующее расщепление связи аргинин—лейцин приводит к высвобождению активного тромбина. В тромбине имеется также ионная пара, аналогичная ионной паре в химотрипсине между положительно заряженной аминогруппой изолейцина-16 и отрицательно заряженным аспартатом-194.

Рис. 8.32. Структура протромбина. В результате расщепления двух пептидных связей (Аrg-274— Тhr-275 и Аrg-323—Ilе-324) образуется тромбин. Красным показан отщепляемый N-концевой фрагмент протромбина, в котором локализованы все остатки γ-карбоксиглутамата. А- и В-цепи тромбина соединены дисульфидной связью

Сходство последовательностей аминокислотных остатков указывает на то, что тромбин эволюционно близок к сериновым протеиназам поджелудочной железы. Подтверждением этому служат также сходство механизмов активации сравниваемых ферментов и наличие в них системы переноса заряда. Примечательно, что протромбин синтезируется в печени, имеющей в процессе эмбриогенеза общее с поджелудочной железой происхождение.

8.23. Для синтеза протромбина необходим витамин К

На протяжении многих лет было известно, что витамин К необходим для синтеза протромбина и ряда других факторов свертывания крови. Однако механизм действия этого витамина удалось раскрыть совсем недавно путем исследования аномального протромбина, синтезируемого в отсутствии витамина К или же в присутствии антагониста витамина К, например, дикумарола. Дикумарол содержится в гниющем доннике, и скот, получающий испорченное сено, погибает от геморрагической болезни. Производное дикумарола используется в медицине в качестве антикоагулянта для предотвращения тромбозов у больных с повышенной свертываемостью крови. Дикумарол, а также варфарин (рис. 8.33), родственный витамину К по структуре и его антагонист, нашли применение и в качестве сильного крысиного яда. Под влиянием дикумарола в крови коров появляется дефектный протромбин, который в отличие от нормального не способен связывать Са^{2 +}. Довольно долго это представлялось загадкой, потому что по количеству содержащихся аминокислот и по аминокислотному составу, определенному после кислотного гидролиза, дефектный протромбин не отличался от нормального. При разделении нормального протромбина на фрагменты было показано, что связывание Са²⁺ происходит в N-концевой области белка (рис. 8.34). Далее было обнаружено, что N-концевой пептид аномального протромбина значительно отличается от соответствующего пептида нормального протромбина по электрофоретической подвижности. Изучение этих пептидов методом ядерного магнитного резонанса позволило установить, что в норме протромбин содержит ранее неизвестную аминокислоту - γ-карбоксилглутамат; в аномальном протромбине эта модифицированная аминокислота отсутствует. Как оказалось, первые десять остатков глутамата в N-концевой области протромбина карбоксилированы в у-карбоксилелутамот, причем это карбоксилирование осуществляется витамин-К-, зависимой ферментативной системой. Указанную аминокислоту не удавалось выявить вплоть до последнего времени, потому что при кислотном гидролизе происходит потеря у-карбоксигруппы и у-карбоксиглутамат определяется как глу-.

Рис. 8.33. Формулы витамина К₂ и двух тамат: его антагонистов-дикумарола и варфарина

Рис. 8.34. Последовательность аминокислот N-концевой части протромбина [остатки у-карбоксиглутамината (GL) показаны красным]