Биохимия человека Том 1 - Марри Р. 1993

Структура и функции белков и ферментов
Ферменты: кинетика
Уравнение Михаэлиса-Ментен

Графическое определение константы Михаэлиса К_М

Концентрация субстрата, при которой скорость составляет половину максимальной, обозначается через К_М и называется константой Михаэлиса. Ее можно определить из графика зависимости г от [S] (рис. 8.14). Обратите внимание, что К_М имеет размерность молярной концентрации.

Когда [S] приближается к К_М, v становится весьма чувствительной к изменению [S]; в этой области фермент работает со скоростью, равной половине максимальной. Многие Ферменты характеризуются такими значениями К_М, которые примерно соответствуют физиологическим концентрациям их субстратов.

Уравнение Михаэлиса—Ментен

Class="center">

описывает поведение многих ферментов при изменении концентрации субстратов. Используя это уравнение, зависимость начальной скорости ферментативной реакции от [S] и К_М можно проиллюстрировать на следующих конкретных примерах.

Рис. 8.15. Схема, поясняющая связывание субстрата ферментом при низкой (А) и высокой (С) концентрации субстрата, а также при концентрации субстрата, равной К_М (В). Состояния А, В и С отвечают точкам А, В, С на кривой, приведенной на рис. 8.14.

1. [S] много меньше К_М (точка Л на рис. 8.14 и 8.15). В этом случае величину [S] в знаменателе можно опустить, и он будет практически равен К_М. Отношение двух констант, V_mаx и К_M, можно заменить новой константой К. Таким образом, имеем:

(≃ означает «примерно равно»).

Другими словами, когда концентрация субстрата значительно ниже той, при которой скорость реакции составляет половину максимальной (т. е. значительно меньше К_M), начальная скорость v пропорциональна концентрации субстрата [S].

2. |S| много больше К_M (точка С на рис. 8.14 и 8.15). В этом случае член КM в знаменателе можно опустить, т. е.

Это означает, что при концентрации субстрата [S], намного превышающей K_M, начальная скорость v равна максимальной V_max.

3. [S] = K_М (точка В на рис. 8.14 и 8.15).

Это означает, что при концентрации субстрата, равной К_M, начальная скорость реакции v составляет половину максимальной. Отсюда же следует способ оценки К_M: надо экспериментально определить концентрацию субстрата, при которой начальная скорость равна половине максимальной.

Для многих ферментов определение V_mах (а значит, и К_M) непосредственно из графика зависимости V от [S] оказывается затруднено. Для этого используют уравнение, обратное уравнению Михаэлиса—Ментен, т. е.

и представляют его правую часть в виде суммы двух слагаемых:

Отсюда, упростив, получаем

Итак, мы имеем уравнение прямой

у = ах + b,

где у = 1/v и x = 1/[S].

Если построить график зависимости у (т.е. 1 /v) от л: (т.е. 1 /[S]), то длина отрезка b, отсекаемого от оси у, будет равна 1/V_mах, а тангенс угла наклона а — K_M/V_max. Длину отрезка, отсекаемого от оси х (в области отрицательных значений), можно получить, приравняв у нулю. Тогда

График уравнения Михаэлиса—Ментен в обратных координатах называют графиком Лайнуивера—Бэрка (рис. 8.16). Используя его, К_M можно найти либо из наклона прямой и длины отрезка, отсекаемого от оси у, либо из длины отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений от оси х. Поскольку [S] имеет размерность молярной концентрации, КM тоже измеряется в молях на литр. Скорость v может быть выражена в любых единицах, поскольку К_M не зависит от [Enz.]. График, построенный в обратных координатах, позволяет определить К_M по относительно небольшому числу точек, именно поэтому он часто используется для нахождения К_M.

Используя график Лайнуивера—Бэрка на практике для оценки К_м, иногда сталкиваются с тем, что почти все точки оказываются в области низких концентраций субстрата. Это происходит в том случае, когда измерения проводят через равные интервалы [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует проводить при таких значениях [S], которые соответствуют равным интервалам по шкале обратных величин.

Альтернативный подход к экспериментальной оценке К_м и V_mах предложили Иди и Хофсти. Уравнение Михаэлиса — Ментен можно преобразовать к виду

Рис. 8.16. Г рафик Лайнуивера — Бэрка в двойных обратных координатах (зависимость 1/v_х от 1 /[S]), используемый для графического Structure/97.html">Определения К_M и V_max.

Чтобы найти К_M и V_max, строят график зависимости v/[S] (ось у) от V (ось х). Тогда длина отрезка, отсекаемого от оси у, будет равна V_mах/К_M, а отрезка, отсекаемого от оси x,— V_max. Тангенс угла наклона равен — 1/К_M.

Уравнения Лайнуивера—Бэрка и Иди — Хофсти весьма удобны в некоторых случаях, однако для строгого определения К_M и V_mах требуется соответствующая статистическая обработка.

Оценки К_м имеют практическую ценность. При концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих К_M фермент будет работать практически с максимальной скоростью, поэтому максимальная скорость (V_max) будет отражать количество присутствующего активного фермента. Это немаловажное обстоятельство используют для оценки содержания фермента в препарате. Значение K_M позволяет ориентироваться, какое количество субстрата следует добавить для определения V_mах. Графики, построенные в обратных координатах, находят широкое применение при оценке действия ингибиторов.

Соотношение между К_M и К_d — константой диссоциации фермент-субстратного комплекса

Сродство фермента к субстрату равно величине, обратной константе диссоциации К_d комплекса Enz—S:

Иными словами, чем слабее выражена тенденция фермент-субстратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату.

Мерой K_d может ориентировочно служить значение К_M для данного фермента по отношению к его субстрату. Однако это возможно только в том случае, если справедливо допущение, использовавшееся при выводе уравнения Михаэлиса—Ментен. Оно состояло в том, что первая стадия ферментативной реакции

идет быстро и при этом всегда на этой стадии поддерживается равновесие. Другими словами, скорость диссоциации Enz—S на Enz + S намного выше,

Из уравнения Михаэлиса—Ментен следует, что величина [S], при которой

равна

Но если

k_-1 » k₂,

то

k₂ + k ≃ k_-1

и

При этих условиях 1/К_M = 1/К_M и равно сродству фермента к субстрату. Если k₂ + k_-1≉ k_-1, то 1/К_M даст заниженную оценку сродства.