Основы биохимической инженерии Часть 1 - Бейли Дж., Оллис Д. 1989

Применение реакций, катализируемых ферментами
Применение гидролитических ферментов
Протеолитические ферменты

Существует множество ферментов, селективно атакующих азотсодержащие соединения, особенно белки. Эти ферменты находят и разнообразные практические применения. Как и амилазы, протеазы разделяются на ферменты, гидролизующие концевые группы (экзопептидазы), и ферменты, расщепляющие внутренние пептидные связи (эндопептидазы).

Поскольку ферменты, эти важнейшие катализаторы всех живых организмов, сами являются белками, неудивительно, что протеолитические ферменты часто синтезируются сначала в неактивной форме. Неактивная форма фермента или хранится в клетке, или транспортируется от места ее синтеза к тому центру, где этот фермент необходим в активной форме; в частности, в клетке транспортируются неактивные формы пепсина, трипсина, химотрипсина и карбоксипептидазы. Активация этих протеолитических ферментов осуществляется по одному из двух путей (рис. 4.4). Интересно отметить, что активация пепсина и трипсина происходит автокаталитически: неактивный предшественник фермента является субстратом для активной формы, поэтому в результате реакции образуется большее количество активной формы фермента. Интересен и тот факт, что после превращения неактивного трипсина или пепсина в активную форму дальнейшее автокаталитическое расщепление фермента не наблюдается. Для активации второй группы ферментов, обычно экзопептидаз, необходимы ионы одного или нескольких определенных металлов. Стандартный метод определения потребности ферментов и других компонентов клетки в ионах металлов заключается в изучении изменения активности раствора фермента в процессе диализа.

В промышленных масштабах протеазы выделяют из организмов животных (из поджелудочной железы), высших растений (из соков и латексов), а также из дрожжей, плесеней и бактерий. Некоторые из протеаз и области их применения перечислены в табл. 4.1.

Свободные протеазы применяются в основном в производстве моющих средств, в химической чистке, при мягчении мяса, в сыроделии (только реннин), дублении, извлечении серебра из фотографических пленок и бумаг, производстве препаратов, способствующих пищеварению, а также в медицине при лечении воспалительных процессов и вирулентных ран. В качестве добавок к моющим средствам ферменты применялись начиная уже с 1913 г., однако особенно резкий рост потребления протеаз в производстве детергентов наблюдался в конце 1960-х гг. Ферменты, способствующие удалению загрязнений белковой природы, представляют собой смесь нейтральной и щелочной бактериальных протеаз, активных в интервале pH от 6,5 до 10,0 при температурах от 30 до 60 °С. Наибольшего уровня производство ферментов для этих целей достигло в 1969 г., когда с ферментными добавками выпускалось 30—75% всех моющих средств в Западной Европе и 40% в США. Затем, однако, Федеральная комиссия по торговле США высказала опасение, что такие детергенты оказывают вредное воздействие на здоровье человека, и в 1970—1971 гг. производство бактериальных протеолитических ферментов резко сократилось. Последовавшее позднее снятие предупреждения Федеральной комиссии и внедрение усовершенствованных методов производства, при которых образование ферментных аэрозолей сводится к минимуму (путем «парафинирования»), способствовали частичному восстановлению спроса на бактериальные протеазы для детергентов. В 1980 г. в США таких протеаз было произведено на сумму около 6 млн. долл.

а) Из предшественников:

б) В присутствии ионов металлов:

РИС. 4.4. Активация протеолитических ферментов, а — образование активных ферментов из предшественников; б — образование активных ферментов в присутствии ионов металлов.

Различные методы мягчения разделанных мясных туш с помощью специальных агентов основаны на протеолитической активности относительно недорогих и устойчивых к действию тепла растительных протеаз папаина и бромелаина. Процесс «созревания» целых туш обычно проводят до их разделки и расфасовки путем контролируемого автолиза при температуре около 15 °С с одновременным облучением ультрафиолетом, который выполняет роль гермицидного препарата и предотвращает рост нежелательных микроорганизмов на поверхности туш.

Сырые ферментные препараты поджелудочной железы различных животных содержат все пищеварительные протеазы, в том числе трипсин, а также липазы и амилазы. Эти смеси, обладающие мощной гидролитической активностью, используются для обезволашивания (удаления волос) шкур животных и одновременного гидролиза других неколлагеновых белков. Поскольку пепсин гидролизует и коллаген (фибриллярный белок, являющийся основой кожного покрова животных), его нельзя применять при выделке кож.

В молочной промышленности широко применяется только один фермент — реннин. Реннин отщепляет гликопептид от растворимого казеината кальция и таким образом превращает его в относительно малорастворимый параказеинат кальция, осаждающийся в виде творожного сгустка. Превращать казеинат кальция в параказеинат могут и другие протеазы, однако катализируемый ими протеолиз обычно на этом не останавливается, а поскольку продукты более глубокой деградации казеина обладают большей растворимостью, то творожный сгусток в этих условиях не образуется. Нехватка животного реннина стимулировала разработку методов получения аналогичных бактериальных ферментов, и последние уже применяются в сыроделии. Для получения реннина теленка с помощью микроорганизмов применяются также методы генетической инженерии.

Протеолитические ферменты применяются в медицине и клинической практике в качестве способствующих пищеварению средств, а также при лечении тяжелых ран. Поскольку ферменты представляют собой белки, то способствующие пищеварению ферменты применяют только в капсулах, предохраняющих ферменты от кислой среды желудка, которая неминуемо вызвала бы их денатурацию. Из перечисленных в табл. 4.1 ферментов нет ни одного, который был бы выделен из организма человека. Введение протеаз животных человеку (а трипсин свиньи, например, отличается от трипсина человека) применяется также для подавления воспалительных процессов в тканях; реакция иммунной системы человека минимальна в случае высокоочищенных кристаллических препаратов ферментов. В отличие от живых мертвые клетки обычно не способны защищать себя от действия протеаз. На этом различии основано применение растворов протеаз для лечения вирулентных или сочащихся ран; протеазы способствуют размягчению омертвевшей ткани и клеток, облегчая тем самым дренаж ран и ускоряя их заживление.

Протеолитические ферменты, особенно трипсин, подавляют воспалительные процессы и опухоли, связанные с внутренними повреждениями и инфекциями. Их действие, вероятно, основано на растворении тромбов и осадков внеклеточных белков или на локальной активации других защитных систем организма, выполняющих те же функции, или на обоих этих факторах одновременно. Протеолитические ферменты тормозят развитие или полностью излечивают ряд тяжелых инфекционных заболеваний, приводящих к накоплению в легких слизи.