Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Дисульфидные связи
Расщепление полипептидной цепи до коротких цистинсодержащих пептидов

Как уже отмечалось ранее, фрагментацию белков следует проводить в условиях, исключающих дисульфидный обмен: предпочтительно в диапазоне pH 2—6,5. Тем не менее для достижения удовлетворительных результатов часто приходится вести реакцию в области более основных pH. Например, с успехом применяют Гидролиз трипсином и термолизином при pH 7,0— 7,5 [19, 30, 41, 42]. Однако ввиду различной стабильности дисульфидных связей в белках при объяснении полученных результатов в этом случае не следует делать поспешных выводов.

Для первоначальной обработки белка часто применяют Пепсин из-за его высокой активности в кислой среде и способности гидролизовать нативные Белки. После того как стабильная структура нативного белка разрушена пепсином, можно проводить дальнейший гидролиз другими ферментами в области pH, оптимальной для сохранения дисульфидных связей. При определении положения дисульфидных связей широко применяется Расщепление бромоцианом в слабокислой среде по остаткам метионина. Метод обладает тем преимуществом, что при этом образуются вполне определенные фрагменты, которые могут быть выделены и использованы для последующей фрагментации.

Выбор ферментов для последующего расщепления определяется различными факторами и преследует цель получить небольшие Пептиды, содержащие одну дисульфидную связь. Наиболее часто применяют обработку трипсином, химотрипсином, стафилококковой протеазой или термолизином в отдельности или в различных сочетаниях. Иногда с успехом используют Ферменты с более узкой специфичностью, например плазмин, эластазу [5, 11]. Для анализа пептидов, содержащих две Дисульфидные связи, разделенные несколькими остатками аминокислот применяют деградацию по Эдману [20].

Особенности методов расщепления при определении дисульфидных связей рассмотрены в настоящей главе, относительно гидролиза протеазами см. гл. 3 и 10, относительно химических методов расщепления см. гл. 1 и 2.