Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидов химическими методами
Расщепление по остатку триптофана
Расщепление с помощью BNPS-скатола

В настоящее время для расщепления пептидов и белков по остатку триптофана применяют главным образом 2-(2-нитрофенилсульфенил)3-бромо-3-метилиндоленин (57) (BNPS-скатол) [45, 50, 132]. Реактив готовят путем бромирования 2-(2-нитрофенилсульфенил)3-метилиндола (56) N-бромосукцинимидом в ледяной уксусной кислоте [132]. В работе [211] предложен модифицированный метод получения BNPS-скатола и спектроскопически подтверждена его «индолениновая» структура.

BNPS-скатол действует более избирательно по сравнению с N-бромосукцинимидом. После обработки смеси аминокислот BNPS-скатолом (10 экв.) в 50%-ной уксусной кислоте при комнатной температуре в течение 30 мин в реакционной смеси полностью исчезает Триптофан, Метионин превращается в метионины-оксид, а остальные Аминокислоты обнаруживаются в гидролизате количественно. Напротив, при аналогичной обработке N-бромосукцинимидом в гидролизате отсутствует не только триптофан, но и метионин, Тирозин, Гистидин, цистин. Как и следовало ожидать, Цистеин легко окисляется BNPS-скатолом до цистина, а при избытке реагента — частично до цистеиновой кислоты. При наличии в белке SH-групп их предварительно защищают, используя подходящий реагент [132].

Как было убедительно показано на примере Нуклеазы [132], для расщепления по триптофану необходима продолжительная инкубация в присутствии избытка реагента (20— 100-кратного). При сокращении времени и небольшом избытке реагента можно обнаружить лишь частичную модификацию триптофана.

Известны многочисленные работы по применению BNPS-скатола в химии белка [51]. Выход продуктов избирательного расщепления по триптофану составляет 40—80%. По-видимому, выход зависит от качества реагента. BNPS-скатол чувствителен к действию света, разлагается при комнатной температуре, темнеет и выделяет бром. В то же время высокоочищенные кристаллические препараты (бледно-желтые звездочки при кристаллизации из лигроина [132]) могут храниться в герметичной упаковке при —20 °С достаточно долго.

2.5.2.1. Методика [123]. Пептид 89—169 основного белка бычьего миелина (1—7 мкмоль/мл) инкубируют с BNPS-скатолом (17 мкмоль/мл) в 75%-ной уксусной кислоте при 37 °С в течение 24 ч. Затем избыток реагента и побочные продукты реакции отделяют повторной экстракцией этилацетатом, водный слой высушивают лиофильно. Очистку пептидных фрагментов ведут с помощью гель-фильтрации.