Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Рентгеновская кристаллография и электронная микроскопия
Электронная микроскопия
Разрешение и ограничения метода

В микроскопии разрешение зависит от длины волны используемого излучения. В световом микроскопе при длине волны 500 нм разрешение не превышает 250 нм. Использование рентгеновской дифракции и расчет изображений с помощью ЭВМ позволяют достичь разрешения 0,1 нм при длине волны излучения 0,15 нм. В электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 100 кВ длина волны электронов составляет ~0,003 нм. Однако по техническим причинам реальное разрешение этих приборов достигает лишь ~0,3 им, что в принципе уже позволяет различать многие детали структуры молекул. К сожалению, в случае биологических материалов чрезвычайно трудно приготовить образцы для исследования, сохранив их структуру неизменной на уровне таких разрешений. Ограничение разрешения обусловлено не микроскопом, а существующими В настоящее время методами подготовки образцов для микроскопирования, позволяющими сохранить исследуемую структуру в вакууме при бомбардировке пучком электронов.

РИС. 20.12. Схема расположения основных линз в электронном микроскопе. В отличие от оптического микроскопа в электронном микроскопе источник излучения располагают сверху, а увеличенное изображение формируется внизу.

Традиционным способом решения этой проблемы является «окрашивание» структур тяжелыми металлами. Поэтому обычно получаемое изображение представляет собой картину распределения окрашивающего вещества в исследуемом образце, на основании которой можно судить об особенностях молекулярной структуры объекта. Разрешение в этих случаях, как правило, не превышает 1,5 нм. Для повышения разрешения вплоть до 0,6 нм сравнительно недавно были разработаны новые методы микроскопирования молекул. В этих методах увеличение отношения величин полезного сигнала и шума достигается, как и в случае рентгеновской дифракции, использованием упорядоченных молекулярных образований — кристаллов. Ниже будут рассмотрены принципы рутинных методов электронной микроскопии, а затем и их новейшие усовершенствования.

РИС. 20.13. В электронном микроскопе образец помещают на угольную пленку, поддерживаемую медной сеточкой (медь обеспечивает хороший электрический и термический контакт препарата с держателем образца). Верхняя часть рисунка иллюстрирует метод негативного контрастирования.