Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Применение масс-спектрометрии электронного удара для определения аминокислотной последовательности пептидов и белков
Способы подготовки проб
Перметилирование

Ацетилпептиды перметилируются следующим образом. Сначала готовится необходимое основание — метилсульфинильный карбанион. Для этого к 3— 4 мл диметилсульфоксида добавляют гидрид натрия (два полных микрошпателя) и реакционную массу выдерживают 20 мин при 90 °С. О ходе реакции судят по интенсивности окрашивания раствора и по скорости выделения пузырьков водорода. Если за это время реакционная масса приобретает оранжево-коричневый цвет и выделение водорода практически прекращается, то считают, что реакция прошла до конца. Если выделение водорода прекращается до появления нужного окрашивания, то к реакционной массе следует добавить гидрид натрия (еще один микрошпатель) и продолжать реакцию до приобретения реакционной смесью нужной окраски. Если в процессе проведения реакции раствор окрашивается в зеленый или красный цвет, то его следует вылить. По окончании реакции массу охлаждают и центрифугируют 10 мин со скоростью 3000 об./мин. При этом в верхней части пробирки собирается жидкость цвета светлого меда, которая содержит необходимое для дальнейшего применения основание.

К растворенному в капле диметилсульфоксида ацетилпептиду добавляют 20—30 капель раствора, содержащего метилсульфинильный карбанион. Чтобы убедиться, что основание добавлено в избытке, капают реакционной смесью на кристаллик трифенилметана, который в этом случае окрашивается в глубокий красный цвет. Примерно через минуту после добавления избытка основания к реакционной массе добавляют 500 мл метилиодида и проводят метилирование в течение 70 с [21, 22]. По прошествии указанного времени реакцию останавливают добавлением 2 мл воды. Перметилированные ацетил- Пептиды сразу же экстрагируют 1 мл хлороформа, который предварительно дважды промывают 2 мл воды, и хлороформный экстракт упаривают в потоке азота. Для окончательного удаления следов воды и хлороформа продукт вакуумируют.