Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Фрагментация полипептидов химическими методами
Расщепление дисульфидных связей
Расщепление S-S-групп путем окисления

Окислительное расщепление S—S-групп в белках обычно проводят надмуравьиной кислотой. При этом остатки цистеина и цистина с выходом >90% превращаются в цистеиновую кислоту (15). Цистеиновая кислота стабильна при кислотном гидролизе; при анализе на аминокислотном анализаторе элюируется непосредственно перед аспарагиновой кислотой [180]. Этот прием применяется для Structure/97.html">Определения в белках суммарного содержания цистеина и цистина. При окислении Метионин превращается в S—S-диоксид (16), Триптофан — в N-формилкинуренин (17) и неидентифицированные продукты окисления [7, 192], а Тирозин — частично в галогенпроизводные [77, 160]. Попытки найти условия избирательного окисления цистина и цистеина с целью свести к минимуму Побочные реакции других аминокислот или по крайней мере добиться образования хорошо идентифицируемых продуктов окисления оказались безуспешными. Впервые окисление надмуравьиной кислотой применялось при изучении инсулина [157] и рибонуклеази [77, 84].

Class="center">

2.2.3.1. Окисление надмуравьиной кислотой. Для получения надмуравьиной кислоты смешивают 99%-ную муравьиную кислоту и 30%-ный пероксид водорода в соотношении 95:5 и оставляют стоять в закрытом сосуде при комнатной температуре в течение 2 ч. К этому времени содержание надмуравьиной кислоты в реакционной смеси достигает максимального, а затем постепенно снижается. Навеску белка растворяют в 99%-ной муравьиной кислоте, добавляют метанол (до 20%-ной концентрации), охлаждают до —5°С и добавляют надмуравьиную кислоту (1 мл на 5 мг белка) в соотношении 2:1. Окончательная концентрация белка в реакционной смеси составляет ∼ 0,5%. Инкубируют при —5:—10°С в течение 2—3 ч, разбавляют водой и высушивают лиофилыю. Белок можно выделить из раствора осаждением трихлороуксусной кислотой или оpганическим растворителем. Реакционную смесь можно разбавить вдвое охлажденной водой и диализовать на холоду против воды (дважды) и 1 мМ 2-меркаптоэтанола, а затем высушить лиофильно. См. также разд. 1.5.1.1.