Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение аминокислотной последовательности с использованием 4-диметиламиноазобензол-4'-изоцианата (в ручном варианте)
Реагенты и растворители

ДАБИТЦ синтезируют, как описано в работах [8, 9], или используют коммерческий препарат (фирмы Fluka и Pierce). ФИТЦ (фирма Merck) перегоняют под азотом при пониженном давлении (tкип ≈ 92 °С/12 мм рт. ст.). Пиридин (фирма Merck) трижды перегоняют: 1) над КОН (10 г/л), 2) нингидрином (1 г/л) и 3) КОН (10 г/л). Трифторуксусную кислоту (фирма Fluka) перегоняют над CaSO₄∙0,5H₂O (10 г/л). Можно использовать пиридин («для секвенирования») и ТФУ фирмы Pierce.

Полипептид 1—10 нмоль. Добавляют 80 мкл 50%-ного водного пиридина и 40 мкл ДАБИТЦ в пиридине (10 нмоль/мкл). Инкубируют под азотом при 52 °С 50 мин. Добавляют 10 мкл ФИТЦ и инкубируют еще 30 мин.

Экстрагируют смесью гептан — этилацетат (2:1) по 500 мкл 4 раза. Высушивают досуха в вакууме или в потоке азота.

Добавляют 50 мкл безводной ТФУ. Инкубируют (под азотом) 15 мин при 52 °С. Удаляют растворитель высушиванием в вакууме или в потоке азота.

Добавляют 50 мкл воды. Экстрагируют тиазолиноны 200 мкл бутилацетата и высушивают экстракт в вакууме для превращения в ДАБТГ-производные аминокислот.

Остаток подвергают следующему циклу деградации.

РИС. 14.1. Схема 1. Последовательность стадий в одном цикле жидкофазной деградации с использованием ДАБИТЦ — ФИТЦ-реагента.

Остальные Растворители квалификации «для анализа» применяют без очистки.

Для идентификации используют полиамидные пластинки фирм Schleicher and Schüll или Cheng-Chin Со. Аминирование стеклянных шариков (CPG-75, фирма Serva) и их активацию n-фенилендиизотиоцианатом (ДИТЦ) проводят, как описано в гл. 12 [1].