Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Определение состава белковых олигомеров. Получение мономеров и полипептидных цепей
Получение мономеров с целью секвенирования
Отщепление олигосахаридных фрагментов гликопротеинов

Для отщепления олигосахаридных фрагментов гликопротеинов можно использовать продажный раствор HF в пиридине (реакцию проводят при комнатной температуре в течение 90 мин). Однако этот реагент не всегда действует столь эффективно, как безводный HF, который расщепляет гликозидные связи нейтральных и кислых сахаров при 0 °С в течение 1 ч [124]. К сожалению, при такой обработке изменяются физические свойства белка, хотя образец может быть вполне пригоден для секвенирования.

1.6.4.1. Методика [124]. Реакцию с безводным фтороводородом проводят в специальной аппаратуре, например поставляемой фирмой Peninsula Lab. Inc. Тщательно высушенный образец гликопротеина (до 100 мг) и безводный метанол (до 10% от объема образца) помещают в Реактор. Линию подачи HF вакуумируют, за исключением баллона с жидким HF. Реактор охлаждают сухим льдом в ацетоне и перегоняют в него 10 мл жидкого HF (в качестве поглотителя влаги в жидком HF используют трифторид кобальта). Перегонку проводят при осторожном вращении обоих сосудов. Реактор нагревают естественным путем до подходящей температуры (давление паров HF при 0 °С 364 мм рт. ст. и при 23 °С 850 мм рт. ст.) и с этого момента отсчитывают время начала реакции. Если реакцию проводят при 0°С, реактор охлаждают в ледяной бане. В Заключение реактор эвакуируют через ловушку с CaO. С целью предотвращения вспенивания реакционной смеси вакуум следует набирать постепенно, но достаточно энергично, чтобы быстро отогнать HF, не допуская олигомеризации. После упаривания HF линию выдерживают под вакуумом еще в течение 1 ч. О полноте удаления HF судят по переходу окраски реакционной смеси от светло-коричневой и красноватой в бесцветную. Затем образец растворяют в 0,1 М или 50%-ной уксусной кислоте и немедленно хроматографируют на колонке с сефадексом или диализуют.

При более жесткой обработке безводным HF (23 °С, 3 ч) идет расщепление О-гликозидных связей аминосахаров, однако пептидные и N-гликозидные связи не затрагиваются.