Практическая химия белка - А. Дарбре 1989

Аналитические методы
Количественное определение белка
Определение белка с помощью сульфобромофталенина

Реагент. Смешивают 2,0 мл 1 М НСl, 0,5 мл 1 М лимонной кислоты и 10 мкл раствора динатриевой соли сульфобромофталеина (фирма Baker Chemical) с концентрацией 50 мг/мл воды.

2 М NaOH, содержащий 1 мг/мл дезоксихолата натрия (ДОХ).

Раствор для промывки: смесь 1 М НСl+1 М лимонной кислоты+1 М NаОH (4:1:2).

Методика. В 1,5 мл полипропиленовую центрифужную пробирку помещают образец белка (10 мкл) в воде или буфере. Добавляют такой же объем 2 М NaOH, содержащий ДОХ. Смешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре (если это необходимо для полного растворения белка). Добавляют 50 мкл реагента, смешивают и центрифугируют (в центрифуге Eppendorf Model 3200 при полной скорости, —12 000 g) в течение 1 мин. Удаляют несвязавшийся краситель пипеткой. Добавляют 0,5 мл раствора для промывки. Центрифугируют в этих же условиях и супернатант отбрасывают. Осадок суспендируют в 0,5 мл 0,1 М NaOH на вибраторе и измеряют поглощение при 580 нм. Линейная зависимость наблюдается в диапазоне 0,5—10 мкг белка, при повышении концентрации красителя до 250 мкг/мл линейность сохраняется до 100 мкг белка.

Замечание. Методика не работает в присутствии тритона Х-100 (0,1%) и ДСН (0,1%), взаимодействующих с красителем. Воспроизводимость результатов ухудшается при использовании настольной центрифуги, дающей — 2000g. Возможны перерывы между стадиями во времени. Метод рекомендуется для Structure/97.html">Определения белка в тканях.