БИОХИМИЯ - Основные регуляторы и биологические жидкости человеческого организма - 2016 год

1. ФЕРМЕНТЫ

1.7. Практическая часть. Исследование свойств ферментов

Цель работы - изучить свойства ферментов и особенности протекания биохимических реакций под действием ферментов.

Опыт 1. Ферментативный гидролиз крахмала

С помощью гидролиза изучают состав веществ. Гидролиз может быть: 1) кислотным, 2) щелочным, 3) ферментативным. В первых двух случаях процесс идет при повышенной температуре, а в последнем - при температуре тела человека.

Ферментом, гидролизующим крахмал на составные части (декстрины, мальтозу, глюкозу), является амилаза слюны. Оценку результатов опыта проводят с помощью цветных реакций: Троммера и йодокрахмальной.

Негидролизованный крахмал дает синее окрашивание с раствором йода (I2) (положительная реакция) и отрицательную реакцию Троммера, так как он не обладает восстанавливающей способностью.

Продукты же гидролиза крахмала (мальтоза и глюкоза) не реагируют с раствором йода (отрицательная реакция), но вступают в реакцию Троммера (положительная реакция).

Берут две чистые, сухие пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 10 капель 1 % раствора крахмала. В одну из них добавляют 4 капли воды (контроль), а во вторую - 4 капли раствора слюны в разведении 1:5. Перемешивают и ставят в термостат на 15 минут при 37 °С.

Затем проверяют, прошел ли гидролиз крахмала в каждой из пробирок. Для этого из первой пробирки дважды отбирают по 4 капли исследуемого вещества, вносят их в две новые пробирки и проводят в этих пробирках, соответственно, две реакции: йодокрахмальную в одной и реакцию Троммера в другой.

Аналогичную процедуру выполняют с содержимым второй пробирки. При подготовке отчета результаты опыта заносят в таблицу, построенную по образцу табл. 1.

Таблица 1

Результаты экспериментов

Номер пробирки

Субстрат

Фермент

Реакция с йодом Троммера

1

Крахмал

Без фермента (контроль с водой)

2

Крахмал

Амилаза слюны

1. Йодокрахмальная реакция. К полученному раствору (гидролизату) добавляют 1 - 2 капли 1 % раствора йода (I2) в 2 % растворе йодида калия (КI). Отмечают изменение окрашивания содержимого пробирки.

2. Реакция Троммера. К полученному раствору (гидролизату) добавляют сначала 1 мл 10 % раствора гидроксида натрия (NаОН) для создания щелочной среды, а затем 1 мл 5 % раствора сульфата меди (СUSO4) И нагревают на кипящей водяной бане. Наблюдается ли изменение окрашивания? Будет ли положительной проба Троммера?

Сделать вывод, прошел ли гидролиз крахмала. Что образовалось в результате гидролиза? Привести в отчете ступенчатую схему ферментативного гидролиза крахмала.

Опыт 2. Влияние температуры на активность ферментов

Ферменты очень чувствительны к температуре и проявляют свою наивысшую активность при ее оптимальном значении, которое для ферментов человека составляет 35 - 45 °С. При температуре более 50 °С активность ферментов падает, а затем наступает их инактивация, так как структура активного центра фермента нарушается, и не происходит его соединения с субстратом.

Берут две чистые, сухие пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 10 капель 1 % раствора крахмала. Затем в одну пробирку добавляют 5 капель раствора слюны в разведении 1:5, а в другую - такое же количество предварительно прокипяченной в течение 10 минут слюны (амилаза инактивирована). Обе пробирки встряхивают и помещают в термостат с заданной температурой 37 °С на 15 минут, после чего проверяют, прошел ли гидролиз крахмала в каждой из пробирок. Для этого с содержимым каждой пробирки проделывают реакцию с раствором йода (йодокрахмальную) и реакцию Троммера. Результаты опыта заносят в табл. 2.

Результаты экспериментов

Номер пробирки

Субстрат

Фермент

Реакция

С йодом

Троммера

1

Крахмал

Амилаза слюны

2

Крахмал

Прокипяченная амилаза слюны

В отчете указать, в какой пробирке прошел гидролиз крахмала, а в какой - нет, и почему.

Опыт 3. Влияние рН среды на активность фермента

Для каждого фермента существует оптимальное значение рН среды, при котором он проявляет наивысшую активность. Изменения рН замедляют или полностью тормозят действие ферментов, так как при этом происходит нарушение структуры активного центра (при изменении реакции среды изменяется заряд функциональных групп, входящих в состав активного центра).

В восемь пронумерованных пробирок наливают по 1 мл дистиллированной воды. Затем в пробирку № 1 добавляют 1 мл 0,2 % раствора соляной кислоты (НСI), перемешивают и отбирают из нее 1 мл полученной смеси, которую переносят в пробирку № 2. Содержимое пробирки перемешивают, отбирают 1 мл и переносят в пробирку № 3 и т. д. Из пробирки № 8 отбирают 1 мл содержимого и выливают его. Таким образом, получаются различные разведения соляной кислоты, которые соответствуют различным значениям рН среды.

После этого в каждую пробирку добавляют по 2 мл 1 % раствора крахмала и по 1 мл раствора слюны в разведении 1:10. Пробирки встряхивают и помещают в термостат на 15 минут при 37 °С. Вынутые из термостата пробирки охлаждают и добавляют в каждую из них по 1 капле 1 % раствора йода (I2) в 2 % растворе йодида калия (КI).

В отчете указать, как изменяется окрашивание содержимого в каждой пробирке, и отметить, что полный гидролиз крахмала произошел в пробирках № 5 и № 6, где рН = 6,8 - 7,2, что является оптимальным для действия амилазы.

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов

Одни вещества могут усиливать действие ферментов (активаторы), а другие - тормозить их активность (ингибиторы). Для амилазы активаторами являются анионы хлора, для липазы поджелудочной железы - желчные кислоты. Ингибиторами амилазы выступают ионы меди (II) - Си2+, а ингибиторами цитохромов (ферментов, участвующих в биологическом окислении) - цианиды и т. и.

Берут три сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В пробирку № 1 вносят 1 каплю 3 % раствора хлорида натрия (NаСO). в пробирку № 2 - 1 каплю 1 % раствора сульфата меди (СиSO4), а в пробирку № 3 - 1 каплю воды (контроль). Затем во все пробирки добавляют по 10 капель слюны в разведении 1:5. Содержимое каждой пробирки перемешивают, вносят в каждую пробирку 5 капель 1 % раствора крахмала и оставляют на 5 минут при комнатной температуре. После этого во все пробирки добавляют по 1 капле 1 % раствора йода (I2) в 2 % растворе йодида калия (КI).

В отчете указать:

1) как изменилась окраска раствора в каждой пробирке;

2) в каких пробирках прошла реакция гидролиза крахмала, а в каких - нет.

По результатам наблюдений сделать выводы об активирующей или ингибирующей способности растворов исследуемых солей.

Опыт 5. Белки как противоядие для ионов тяжелых металлов

Взаимодействие ионов металлов с белками лежит в основе использования молока как противоядия при отравлении организма человека тяжелыми металлами.

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В опытную пробирку № 1 наливают по 1 мл раствора амилазы, 1 % раствора крахмала, 1 % раствора ацетата свинца (II) - (Ас)2Рb и молока. В контрольную пробирку № 2 наливают по 1 мл растворов амилазы, крахмала, ацетата свинца (II) и воды. Пробирки встряхивают и выдерживают в термостате 20 минут при температуре 30 °С. Добавляют в обе пробирки по 1 капле 1 % раствора йода (I2). В обеих пробирках есть ионы свинца (Рb2+), инактивирующие амилазу. Но в присутствии молока активность амилазы сохраняется, о чем свидетельствует отсутствие синего окрашивания раствора при добавлении раствора йода (отрицательная реакция, так как крахмал гидролизовался).

В отчете указать, как изменилась окраска раствора в каждой из пробирок и почему.

Опыт 6. Обнаружение каталазы в пищевых продуктах

Фермент каталаза содержится в некоторых сырых продуктах - молоке, мясе, картофеле и др. Каталазу обнаруживают, используя ее способность разлагать перекись водорода с выделением газообразного кислорода:

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их. В обе пробирки вносят по 5 капель перекиси водорода (Н2O2). В первую пробирку добавляют 5 капель сырого молока, во вторую - 5 капель кипяченого. В первой пробирке происходит выделение газа, заставляющее вспыхивать поднесенную тлеющую лучинку, во второй этого не происходит. Вместо молока можно взять кусочки сырого и вареного мяса или сырого и вареного картофеля.

В отчете указать, в какой пробирке наблюдалось выделение газа, и сделать вывод о наличии каталазы в исследуемых продуктах питания.

Опыт 7. Обнаружение тирозиназы в картофеле

Тирозиназа (катехолоксидаза) относится к группе ферментов, окисляющих фенолы и родственные им соединения, в частности тирозин. По химической структуре тирозиназа является металлопротеидом, содержащим медь в количестве 0,20 - 0,25 %. Медь служит переносчиком электронов от субстрата на кислород воздуха. Тирозиназа содержится во многих растениях, грибах, а также в отдельных органах и тканях животных.

Под влиянием тирозиназы тирозин окисляется до красного пигмента, а при дальнейшем окислении переходит в черный пигмент меланин. Превращение красного пигмента в меланин может протекать и в отсутствие тирозиназы, достаточно действия кислорода воздуха.

Для получения ферментного препарата тирозиназы сырой картофель очищают от кожуры, верхние слои клубня в количестве 2,0 - 4,0 г разрезают на кусочки, растирают в ступке с 10 мл дистиллированной воды и фильтруют через два слоя марли.

Берут две сухие, чистые пробирки, нумеруют их и в обе вливают по 1 мл полученного фильтрата. Содержимое одной пробирки кипятят 1 - 2 минуты и охлаждают под струей водопроводной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,1 % раствора тирозина, содержимое пробирок перемешивают и помещают в водяную баню при 37 - 40 °С. Периодически пробирки энергично встряхивают для лучшего соприкосновения компонентов смеси с воздухом. Постепенно в одной пробирке под действием тирозиназы раствор темнеет за счет образования продуктов окисления черного цвета типа меланинов. В контрольной пробирке, где фермент инактивирован нагреванием, цвет жидкости не изменяется.

В отчете указать, как изменилась окраска в пробирках и почему.