ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

3. МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ

Цель работы: получить представление о работе с чистыми культурами микроорганизмов; научиться готовить фиксированные окрашенные и прижизненные препараты микроорганизмов и препараты-отпечатки.

В практике микробиологии морфологию, биохимию и физиологию микроорганизмов изучают, используя чистые культуры микроорганизмов. Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов, являющихся потомством одной клетки.

При работе с чистыми культурами следует соблюдать определенные условия, которые позволили бы предохранить их от загрязнения другими микроорганизмами. Все операции проводят в зоне горящей спиртовки. Мелкие предметы (предметные стекла, пинцеты, ножницы, бактериологические петли и иглы) стерилизуют - фламбируют (от нем. flamme - пламя) в пламени спиртовки. Микроорганизмы, выращенные на плотной среде, извлекают из пробирки с помощью бактериологической петли или иглы. Для взятия бульонной культуры используют стерильную пипетку или петлю.

3.1. Приготовление фиксированных окрашенных препаратов микроорганизмов

Цель фиксации: убить клетки микроорганизмов и зафиксировать их на поверхности предметного стекла, чтобы они не были смыты при окрашивании и промывке водой; улучшить окраску клеток, поскольку мертвые клетки становятся более проницаемыми для красителей.

Порядок приготовления фиксированного окрашенного препарата при взятии культуры микроорганизмов, выращенных в пробирке на скошенном питательном агаре, следующий:

1. Зажечь спиртовку.

2. Взять чистое предметное стекло и профламбировать его, пронеся несколько раз сквозь пламя спиртовки.

3. Охладить стекло на столе и нанести на него каплю воды из флакона.

4. Взять пробирку с культурой в левую руку между большим и указательным пальцами и держать в наклонном положении так, чтобы было видно содержимое пробирки.

5. Взять в правую руку бактериологическую петлю, накалить докрасна проволоку в пламени спиртовки и обжечь примыкающую к проволоке часть держателя.

6. Мизинцем и безымянным пальцем правой руки прижать к ладони ватную пробку, вынуть ее из пробирки и держать в таком положении, не касаясь окружающих предметов.

Внимание! Класть пробку на стол или другие поверхности нельзя во избежание ее контаминации микроорганизмами (от лат. contaminatio - приведение в соприкосновение).

7. Края открытой пробирки обжечь в пламени спиртовки.

8. Ввести петлю в пробирку и, охладив ее о стенки пробирки, взять небольшое количество культуры с поверхности питательной среды.

Внимание! Питательный агар нельзя нарушать петлей.

9. Снова обжечь края пробирки в пламени горелки и закрыть ее, пронося пробирку сквозь пламя и надевая ее на пробку. Пробирку с культурой поставить в штатив.

10. Извлеченный из пробирки петлей материал внести в каплю воды на предметном стекле и после аккуратного перемешивания тонким слоем равномерно распределить по поверхности стекла.

11. Оставшиеся на петле клетки микроорганизмов тщательно сжечь в пламени горелки, после чего петлю поставить на место.

12. Суспензию микроорганизмов высушить в потоке горячего воздуха над пламенем спиртовки и зафиксировать, пронося 3-4 раза над пламенем (нельзя фиксировать невысушенные мазки).

13. После охлаждения стекло положить на мостик и окрасить метиленовым синим в течение 2 мин, следя по песочным часам.

14. Краску смыть водой, препарат осушить фильтровальной бумагой, осторожно прикладывая ее к предметному стеклу.

15. На окрашенный препарат нанести каплю кедрового масла. Предметное стекло положить на предметный столик, при помощи макровинта погрузить иммерсионный объектив (90х) в масло и найти микроскопическую картину, используя для установления четкости изображения микровинт.

Внимание! Нельзя использовать микровинт для поиска изображения микробов в препарате.

3.2. Приготовление прижизненных препаратов микроорганизмов

Прижизненные препараты используют для исследования микробов в живом виде с целью наблюдения их подвижности, прорастания спор, способа деления и т. д. Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов - «раздавленная капля» и «висячая капля».

Препарат «раздавленная капля». На чистое предметное стекло наносят из флакона каплю воды. В нее из пробирки вносят петлей небольшое количество исследуемой культуры и осторожно перемешивают, не размазывая по стеклу. Культуру, выращенную в жидкой среде (суспензию микроорганизмов), наносят на предметное стекло пипеткой.

Суспензию микроорганизмов накрывают сверху покровным стеклом так, чтобы под ним не было пузырьков воздуха, мешающих исследованию. Избыток выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой, прикладывая ее к краям покровного стекла.

На покровное стекло наносят каплю кедрового масла и рассматривают препарат с иммерсионным объективом при опущенном конденсоре. Активно движущиеся бактерии проплывают через все поле зрения, меняют направления, совершают вращательные и круговые движения.

Препарат «висячая капля». Для приготовления такого препарата требуются специальное предметное стекло с лункой посередине и обычное покровное стекло. Края лунки предметного стекла смазывают вазелином. Небольшую каплю бульонной культуры микроорганизмов (суспензию) наносят на середину покровного стекла. Предметное стекло переворачивают лункой вниз и опускают ее на покровное стекло таким образом, чтобы находящаяся на нем капля суспензии приходилась на центр лунки.

Предметное стекло слегка прижимают к покровному, и стекла склеиваются. Препарат приподнимают и быстро переворачивают покровным стеклом кверху. Получается герметическая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно подготовленном препарате капля должна свободно свисать с покровного стекла и не соприкасаться с дном или краями лунки. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и рассматривают с объективом 90х в затемненном поле зрения (при суженной диафрагме и опущенном конденсоре).

3.3. Приготовление препарата-отпечатка

Препарат-отпечаток используют для изучения естественного расположения клеток микроорганизмов на поверхности субстрата или пищевого продукта. Чистое предметное стекло фламбируют и прикладывают к поверхности исследуемого продукта (мяса, рыбы, сыра и т. п.). Препарат-отпечаток фиксируют над пламенем спиртовки и окрашивают метиленовым синим или по Граму. На препарат наносят каплю кедрового масла и микроскопируют с иммерсионным объективом.

3.4. Красители и индикаторы рН, используемые в микробиологической практике

Без окрашивания микроорганизмы (кроме грибов) не видны в световой микроскоп из-за их малой контрастности. В микробиологической практике окрашивание широко используют для определения формы, размеров, структуры, взаимного расположения микробов. Способы окрашивания фиксированных препаратов разделяются на простые и сложные. Для простых способов окрашивания микроорганизмов применяют основные и кислые анилиновые красители. У основных красителей хромофором (ионом, придающим окраску) является катион, у кислых - анион. Основные красители более интенсивно связываются с ядерными компонентами клетки. Кислые красители хорошо окрашивают цитоплазматические компоненты клеток.

К основным красителям относятся: красные - нейтральный красный, фуксин основной, сафранин, тионин, пиронин, гематоксилин;

• синие - метиловый синий, «Виктория»;

• фиолетовые - кристаллический фиолетовый, генциан фиолетовый;

• зеленые - янус зеленый, малахитовый зеленый, метиловый зеленый;

• черные - ни дул ни.

К кислым красителям относятся:

• красные и розовые - фуксин кислый, эозин, эритрозин;

• желтые - конго, пикриновая кислота, флуоресцин;

• черные - нигрозин.

При простых способах окрашивания нельзя установить структуру микробов, а также зачастую их дифференцированное отношение к красителям. Для достижения этих целей применяют сложные способы окрашивания. К сложным способам относятся метод Грама (см. раздел 7.2), выявление кислотоустойчивости по Цилю-Нельсену, определение зерен полифосфатов по Леффлеру (см. раздел 6.3), выявление спор бактерий по Цилю-Нельсену или по Пешкову (см. раздел 7.4), выявление капсул по Гинсу-Бурри (см. раздел 7.5) и др.

Индикаторы рН - органические вещества, которые реагируют на изменение активной кислотности среды изменением ее цвета. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы изменяют кислотнощелочное соотношение среды, в которой они развиваются, поэтому индикаторы используют для регистрации этих изменений. Индикаторы, окрашенные в одной среде и бесцветные в другой, называют одноцветными, а индикаторы, имеющие разную окраску по ту и другую стороны интервала, называют двуцветными.

В микробиологии наиболее часто употребляются двуцветные индикаторы, приведенные в табл. 3.1.

Таблица 3.1. Двуцветные индикаторы

Индикатор

рН, при котором изменяется окраска

Изменение цвета

Тимоловый синии (кислый)

1,2-2,8

Красный —> желтый

Бромфеноловый синий

3,0-4,6

Желтый —> синий

Бромкрезолгрюн

3,8-5,4

Желтый —> синий

Метиловый красный

4,4-6,0

Красный —> желтый

Бромкрезоловый пурпурный

5,2-6,8

Желтый —>пурпурный

Бромтимоловый синий

6,0-7,6

Желтый —> синий

Феноловый красный

6,8-8,4

Желтый —> красный

Крезоловый красный

7,2-8,8

Желтый —> красный

Тимоловый синий (щелочной)

8,0-9,6

Желтый —> синий

Например, при идентификации микроорганизмов для установления их сахаролитических свойств используют так называемый «цветной ряд» Гисса. Среды Гисса готовят на 1 %-й пептонной воде с добавлением 0,5—1,0 %-го углевода и индикатора Андреде (с кислым фуксином) или бромтимолового синего. Начальный цвет среды (а также при отсутствии ферментативной активности) - соломенножелтый с индикатором Андреде или сине-зеленый с бромтимоловым

синим. Засеянные пробирки со средой Гисса инкубируют при оптимальной температуре в течение 24 ч. Микроорганизмы расщепляют углеводы с образованием кислоты, за счет чего изменяется цвет среды: розово-красной становится среда с индикатором Андреде, желтой - среда с бромтимоловым синим.

Контрольные вопросы

1. Какие условия необходимо соблюдать при взятии чистой культуры микроорганизмов для приготовления препарата?

2. Каковы цели фиксации препарата?

3. Каковы способы приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов?

4. Какие простые и сложные способы окрашивания препаратов микроорганизмов Вы знаете?

5. Какие красители используют для окрашивания микроорганизмов?

6. Какие индикаторы рН используют в микробиологической практике?