ОБЩАЯ И ПИЩЕВАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ ЧАСТЬ I - Л. В. Красникова - 2016

2. ОРГАНИЗАЦИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

Цель работы: ознакомить студентов с оборудованием микробиологической лаборатории, методами и средствами стерилизации питательных сред, посуды, инвентаря.

Микробиологическая лаборатория должна включать следующие помещения:

• лабораторные комнаты для проведения исследований;

• застекленный бокс для выполнения работ, требующих соблюдения повышенной стерильности;

• моечную, оборудованную для мытья посуды;

• препараторскую, приспособленную для приготовления питательных сред, подготовки посуды для стерилизации, приготовления реактивов;

• отделение для стерилизации, в котором установлены автоклавы. Все помещения лаборатории должны иметь хорошее естественное и искусственное освещение. Поверхность столов и полы покрывают легко моющимся материалом (пластик, линолеум); в боксе, автоклавной и моечной стены и полы покрывают плиткой. Для стерилизации воздуха в помещениях лаборатории устанавливают бактерицидные лампы (БУВ-15, БУВ-30 и др.).

Оборудование: автоклавы, термостаты, шкафы сухожаровые, микроскопы, холодильники, весы технические, аппарат для микробиологического анализа воздуха помещений, прибор для подсчета колоний микроорганизмов, анаэростат для культивирования анэробных бактерий, рН-метр.

Посуда и инвентарь: петли и иглы бактериологические, шпатели Дригальского, ножницы, пинцеты, штативы, посуда лабораторная (чашки Петри, пробирки, пипетки - чаще всего на 1,0 и 0,1 см3, предметные и покровные стекла, флаконы для красок и растворов), вата, марля, фильтровальная бумага.

2.1. Методы и средства стерилизации, применяемые в микробиологической практике

Стерилизация (от лат. sterilis - бесплодный) в микробиологической практике и пищевой промышленности означает уничтожение в материалах всех вегетативных клеток микроорганизмов и их спор. Стерилизация является одним из важнейших и необходимых приемов в микробиологической практике.

Существуют следующие способы стерилизации:

Термическая стерилизация

• прокаливание в пламени (фламбирование);

• кипячение;

• сухой жар;

• насыщенный пар под давлением;

Холодная стерилизация

• фильтрование;

• облучение;

Дезинфекция.

Термическая стерилизация

Фламбирование - стерилизация путем прокаливания мелких предметов в пламени спиртовки или горелки (предметные стекла, бактериологические петли, иглы, пинцеты, ланцеты и т.п.). В пламени обжигают также горлышки колб, пробирок при пересевах культур и розливе питательных сред.

Кипячение применяют для стерилизации металлических инструментов, игл, резиновых трубок. Инструменты кипятят в специальных металлических стерилизаторах с крышками в течение 30-40 мин. Однако даже весьма продолжительное кипячение не обеспечивает полной стерильности объекта, так как споры ряда анаэробных клостридий могут выдерживать кипячение в течение 3 ч.

Стерилизация сухим жаром. Стеклянную посуду (пипетки, пробирки, колбы, чашки Петри и др.) выдерживают в сухожаровом шкафу при температуре от 160 до 180 °С в течение 1,0-1,5 ч. При такой обработке погибают вегетативные клетки и споры микроорганизмов.

Перед стерилизацией посуду моют и высушивают. Пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками. Пробирки заворачивают в бумагу по 10-20 штук. На колбы надевают бумажные колпачки, предохраняющие горлышко от пыли. В концы пипеток, которые берут в рот, вставляют ватные тампоны. Пипетки помещают в специальные стеклянные или металлические пеналы, или заворачивают в бумагу. При работе пипетки вынимают из пенала только за верхний конец, в который вставлен тампон. Чашки Петри заворачивают в бумагу (каждую отдельно или по 2-3 шт.). Посуду, подготовленную для стерилизации, загружают в сушильный шкаф не слишком плотно, чтобы обеспечить равномерный ее нагрев. По окончании стерилизации шкаф отключают, но не открывают до тех пор, пока температура в нем не снизится до 100-70 °С, чтобы предохранить посуду от растрескивания. Для сохранения стерильности посуду разворачивают непосредственно перед работой.

Стерилизация насыщенным паром под давлением - один из наиболее распространенных и эффективных методов, основанный на том, что пар, образующийся при кипячении воды, скапливается в замкнутом пространстве и повышает давление. При увеличении давления повышается температура пара (табл. 2.1).

Таблица 2.1. Соотношение показаний манометра и температуры насыщенного пара

Показания манометра, МПа

Температура насыщенного пара, °С

Показания манометра, МПа

Температура насыщенного пара, °С

0,00

100

0,15

128

0,05

112

0,20

134

0,10

121

0,30

144

Стерилизацию проводят в специальных герметически закрывающихся двустенных аппаратах - автоклавах. Принцип работы автоклава основан на возрастании температуры кипения воды при повышении давления. Воду в автоклаве нагревают для образования пара при помощи электрической энергии. Основными частями автоклава являются: кожух, водопаровая камера, стерилизационная камера, крышка с резиновой прокладкой. Дополнительно к автоклаву прилагаются: манометр с сифонной трубкой и трехходовым краном, водомерная стеклянная трубка для контроля уровня воды в водопаровой камере, предохранительный клапан для предупреждения чрезмерного повышения давления в автоклаве, воздушный и спускной клапаны для удаления воздуха вначале стерилизации и для удаления конденсата из стерилизационной камеры.

В автоклавах стерилизуют питательные среды, физиологические растворы, резиновые предметы, стеклянную посуду с резиновыми пробками. Режим стерилизации (температура и продолжительность обработки) определяется составом питательной среды, значением рН. Среды, содержащие сахара, молоко, витамины, стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 15-20 мин, мясопептонные среды - при давлении 0,10 МПа в течение 20-30 мин. Время стерилизации отсчитывают от момента установления необходимого давления.

При низком значении рН некоторые вещества, входящие в состав питательной среды, в процессе стерилизации подвергаются гидролизу. Во избежание этого растворы некоторых компонентов (аминокислоты, витамины) стерилизуют отдельно и добавляют в среду после стерилизации.

Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) - метод, применяемый для обеспложивания питательных сред, изменяющих свой состав при воздействии температур выше 100 °С. Сущность, дробной стерилизации состоит в том, что нагревание среды проводят по 15-30 мин при температуре 100 °С в течение трех дней подряд. После первого прогревания погибают вегетативные клетки, некоторые споры при этом сохраняются и затем прорастают. Образовавшиеся из термоустойчивых спор вегетативные формы погибают при повторном нагревании. Дробную стерилизацию проводят в аппарате Коха или в автоклаве при открытом спускном кране.

Тиндализация - дробная стерилизация материалов, легко разрушающихся при высокой температуре (сыворотки, витамины, некоторые антибиотики). Стерилизацию проводят прогреванием объекта при температуре от 60 до 65 °С в течение 60 мин 5-6 дней подряд или при температуре 70-80 °С в течение 3 дней.

Холодная стерилизация

Фильтрование через бактериальные фильтры. Фильтрование через мелкопористые фильтры применяют в тех случаях, когда повышенная температура может резко изменить качество стерилизуемых материалов. Кроме того, стерилизация фильтрованием используется для очистки бактериальных токсинов и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Существуют два основных типа фильтров - глубинные и мембранные.

Глубинные фильтры состоят из волокнистых материалов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Бактериальные фильтры изготавливаются из разного материала и с разным диаметром пор, что указывается на упаковке. Для стерилизации фильтрованием используют пластинчатые асбестовые фильтры Зейтца, свечи Шамберлана, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, свечи Беркефельда из инфузорной земли и асбеста.

Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру, они состоят из нитроклетчатки, и захват ими частиц определяется размером пор. Мембранные фильтры обозначают номерами от 1 до 5 в зависимости от диаметра пор (350-1200 нм).

Стерилизацию фильтрованием осуществляют под вакуумом с использованием вакуумного или водоструйного насоса. Перед началом работы фильтры закрепляют в специальном держателе, который соединяют с колбой Бунзена. Установку для фильтрования стерилизуют в автоклаве в течение 30-40 мин при 0,15 МПа. Мембранные и асбестовые фильтры используют однократно. Свечи Шамберлана и Беркефельда после окончания фильтрования промывают дистиллированной водой, просасывая ее в обратном направлении, и обрабатывают для повторного использования.

Стерилизация облучением. Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для уничтожения микроорганизмов в воздухе помещений, на поверхности пищевых продуктов перед их упаковкой. Ее проводят с помощью бактерицидных ламп различной мощности (длина волны 253-265 нм). Ионизирующее излучение применяют для стерилизации некоторых упаковочных материалов, используемых в пищевой промышленности.

Дезинфекция

Уничтожение микроорганизмов при помощи химических веществ называется дезинфекцией (от лат. infektia - инфекция и французской отрицательной приставки des). Химические вещества применяются для уничтожения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды - на рабочем месте, в помещениях, на рабочей одежде, руках, технологическом оборудовании и инвентаре.

К веществам, используемым с целью дезинфекции, предъявляется целый ряд требований:

• они должны хорошо растворяться в воде;

• в короткие сроки проявлять бактерицидное действие;

• не оказывать токсического действия на человека и животных;

• не вызывать порчу обеззараживаемых предметов.

Дезинфицирующие вещества подразделяют на несколько групп:

1) хлорсодержащие соединения (хлорная известь, натрия гипохлорит, хлорамин, пантоцид, хлордезинсульфохлорантин и др.);

2) соединения на основе йода и брома (йодопирин, дибромантин);

3) окислители (пероксид водорода, перманганат калия и др.);

4) фенолы и их производные (фенол, лизол, креолин, гексахлорофен);

5) соли тяжелых металлов (мертиолят натрия, сулема). Антимикробным действием обладают также кислоты и их соли (борная, салициловая), щелочи, спирты (70 %-й раствор этанола), альдегиды (формальдегид).

Выпускаются также бактерицидные мыла: феноловое, дегтярное, «Гигиена», содержащие 3-5 % гексахлорофена.

Контрольные вопросы

1. Какие методы стерилизации Вы знаете?

2. Какие методы стерилизации относятся к термическим?

3. Как подготовить лабораторную посуду для стерилизации?

4. Какие факторы определяют режим стерилизации?

5. В каких случаях используют «холодные» методы стерилизации?

6. Какие требования предъявляют к дезинфицирующим веществам?

7. Какие вещества используют для дезинфекции?