ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ - Е.П. СУЧКОВА - 2016

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МИКРООРГАНИЗМАМ-ПРОДУЦЕНТАМ

Цель занятия - ознакомиться с требованиями, предъявляемыми к микроорганизмам-продуцентам целевого биотехнологического продукта.

Ход работы. Выполняются задания:

Задание 1. Ознакомиться с требованиями, предъявляемыми к микроорганизмам-продуцентам первичных и вторичных метаболитов в биотехнологическом производстве.

Задание 2. Ознакомиться с основными видами микроорганизмов, применяемых в биотехнологическом производстве, и критериями оценки эффективности биотехнологических процессов.

Выполнение лабораторной работы предусматривает опережающую теоретическую подготовку и использование учебнометодической литературы на занятии.

Теоретическое обоснование

Ассортимент продуктов, получаемых в биотехнологических процессах, чрезвычайно широк. По разнообразию и объемам производства на первом месте стоят продукты, получаемые в процессах, основанных на жизнедеятельности микроорганизмов. Эти продукты подразделяются на три основные группы:

1- я группа - биомасса, которая является целевым продуктом (белок одноклеточных) или используется в качестве биологического агента (биометаногенез, бактериальное выщелачивание металлов);

2- я группа - первичные метаболиты - низкомолекулярные соединения, необходимые для роста микроорганизмов в качестве строительных блоков макромолекул, коферментов (аминокислоты, витамины, органические кислоты);

3- я группа - вторичные метаболиты (идиолиты) - соединения, не требующиеся для роста микроорганизмов и не связанные с их ростом (антибиотики, алкалоиды, гормоны роста и токсины).

Среди продуктов микробиологического синтеза огромное количество различных биологически активных соединений, в том числе белковых и лекарственных веществ, ферментов, а также энергоносители (биогаз, спирты) и минеральные ресурсы (металлы), средства для борьбы с вредителями сельскохозяйственных культур (биоинсектициды) и биоудобрения. В связи с развитием новейших методов биотехнологии (инженерной энзимологии, клеточной и генной инженерии) спектр целевых продуктов непрерывно дополняется. Среди них все большее место занимают средства диагностики и лечения (гибридомы, моноклональные антитела, вакцины и сыворотки, гормоны, модифицированные антибиотики).

Основными элементами, слагающими биотехнологические процессы, являются биологический агент, субстрат, аппаратура и продукт. Биологический агент - активное начало в биотехнологических процессах и один из наиболее важных ее элементов. Номенклатура биологических агентов бурно расширяется, но до настоящего времени важнейшее место занимает традиционный объект - микробная клетка. Микробные клетки с различными химико-технологическими свойствами могут быть выделены из природных источников и далее с помощью традиционных (селекция, отбор) и новейших (клеточная и генетическая инженерия) методов существенно модифицированы и улучшены.

При выборе биологического агента и постановке его на производство прежде всего следует соблюдать принцип технологичности штаммов. Это значит, что микробная клетка, популяция или сообщество особей должны сохранять свои основные физиологобиохимические свойства в процессе длительного ведения ферментации. Промышленные продуценты также должны обладать устойчивостью к мутационным воздействиям, фагам, заражению посторонней микрофлорой (контаминации); характеризоваться безвредностью для людей и окружающей среды, не иметь при выращивании побочных токсичных продуктов обмена и отходов, иметь высокие выходы продукта и приемлемые технико-экономические показатели. В настоящее время многие промышленные микробные технологии базируются на использовании гетеротрофных организмов, а в будущем решающее место среди продуцентов займут автотрофные микроорганизмы, не нуждающиеся для роста в дефицитных органических средах, а также экстремофилы - организмы, развивающиеся в экстремальных условиях среды (термофильные, алкало- и ацидофильные).

В промышленной биотехнологии применяют 3 вида штаммов микроорганизмов:

1) природные штаммы, улучшенные естественным и искусственным отбором (при производстве микробной биомассы);

2) штаммы, полученные в результате индуцированного мутагенеза;

3) генно-модифицированные (рекомбинантные) штаммы, обладающие самой высокой генетической нестабильностью.

Промышленные штаммы должны удовлетворять следующим требованиям:

1. Безвредность для потребителя и обслуживающего персонала.

2. Высокая скорость роста биомассы и целевого продукта (БАВ) при экономичном потреблении питательной среды.

3. Направленная биосинтетическая активность при минимальном образовании побочных продуктов.

4. Генетические однородность и стабильность в отношении к субстратам и условиям культивирования.

5. Отсутствие токсических веществ в целевом продукте и промышленных стоках.

6. Устойчивость к фагам и другой посторонней микрофлоре.

7. Способность расти на дешевых и доступных субстратах, отходах пищевой и химической промышленности при высокой плотности клеток.

Только по совокупности этих и других свойств можно оценить полезность и рентабельность продуцента. Наиболее изучены и чаще применяются в биотехнологии бактерии рода Clostridium, Thermoanaerobacter, Bacillus, Acetobacter, Pseudomonas, Brefibacterium. Основные виды микроорганизмов, используемых в промышленности для получения целевых продуктов, представлены в табл. 1.

Таблица 1. Микроорганизмы, используемые в промышленности для получения целевых продуктов

Организм

Тип

Продукт

Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи

Пекарские дрожжи, вино, эль, саке

Streptococcus thermophilus

Бактерии

Йогурт, ряженка

Propionibacterium shermanii

Бактерии

Швейцарский сыр

Gluconobacterium suboxidans

Бактерии

Уксус

Penicillium roquefortii

Плесень

Сыры типа рокфора

Aspergillus oryzae

Плесень

Саке

Saccharomyces cerevisiae

Дрожжи

Этанол

Clostridium acetobutylicum

Бактерии

Ацетон

Xanthomonas campestris

Бактерии

Полисахариды

Corynebacterium glutamicum

Бактерии

L-Лизин

Candida utilis

Дрожжи

Микробный белок

Propionibacterium shermanii

Бактерии

Витамин В12

Aspergilus oryzae

Плесень

Амилаза

Kluyveromyces fragilis

Дрожжи

Лактаза

Saccharomycopsis lipolytica

Дрожжи

Липаза

Bacillus

Бактерии

Протеазы

Endothia parasitica

Плесень

Сычужный фермент

Leocanostoc mesenteroides

Бактерии

Декстран

Xanthomonas campestris

Бактерии

Ксантан

Penicillium chrysogenum

Плесень

Пенициллины

Chehalosporium acremonium

Плесень

Цефалоспирины

Rhizopus nigricans

Плесень

Трансформация стероидов

Гибридомы

Иммуноглобулины и моноклональные антитела

E. coli (рекомбинантные

Бактерии

Инсулин, гормон роста,

штаммы)

интерферон

Blakeslea trispora

Плесень

β-Каротин

Bacillus thuringiensis

Бактерии

Биоинсектициды

Bacillus popilliae

Бактерии

Биоинсектициды

Одноклеточные организмы характеризуются более высокими скоростями процессов синтеза, чем высшие растения и животные. Они могут перерабатывать в сутки объем биомассы, превышающий массу клетки в 30-40 раз. В действительности действуют разнообразные ограничивающие факторы. Однако возможности бактерий к быстрому размножению намного превосходят возможности других видов организмов, это их свойство является важнейшим при производстве микробного белка и БАВ.

Бактерии биохимически универсальны, могут усваивать самые разнообразные питательные вещества и даже способны выбирать наилучшие органические соединения из смеси, поэтому могут приспосабливаться к самым разнообразным условиям существования.

В последние годы расширяется применение смешанных микробных культур и их природных ассоциаций. По сравнению с монокультурами микробные ассоциации способны ассимилировать сложные, неоднородные по составу субстраты, минерализуют сложные органические соединения, имея повышенную способность к биотрансформации, имеют повышенную устойчивость к воздействию неблагоприятных факторов среды и токсических веществ, а также повышенную продуктивность и возможность обмена генетической информацией между отдельными видами сообщества. Основные области применения смешанных культур: охрана окружающей среды, биодеградация и усвоение сложных субстратов, пищевая промышленность.

В любом биотехнологическом процессе ключевую роль играют биологический агент, его природа и физиологотехнологические свойства. Для роста любого биообъекта нужны исходный жизнеспособный посевной материал, источники энергии и углерода, питательные вещества для синтеза биомассы, отсутствие действия ингибиторов роста, соответствующие физико-химические условия ферментации (рН, температура, аэрация и др.).

Процессы культивирования микроорганизмов в биотехнологических производствах направлены на получение целевых продуктов, в качестве которых могут выступать как клетки микроорганизмов, так и продукты их жизнедеятельности. В то же время термин «культивирование» неразрывно связан с ростом и размножением клеток микроорганизмов.

Критериями оценки эффективности биотехнологических процессов являются: скорость роста продуцента, выход продукта, экономический коэффициент, непродуктивные затраты энергии, энергозатраты и затраты на обезвреживание отходов.

Рост - необратимое увеличение живой клеточной массы, приводящее к увеличению числа клеток микроорганизмов в результате размножения. Важнейшей количественной характеристикой этого процесса является удельная скорость роста μ, выражающая увеличение биомассы клеток в единицу времени.

Скорость роста продуцента служит одним из основных показателей, характеризующих адекватность условий ферментации. Скорость роста (увеличение биомассы) организмов с бинарным делением в хорошо перемешиваемой среде в периодической культуре будет пропорциональна концентрации микробной биомассы:

dХ/dt = μХ,

где dX/dt - скорость роста; Х - биомасса; μ - коэффициент пропорциональности (удельная скорость роста).

Удельная скорость роста ц является одним из основных параметров, определяющих физиологическое состояние продуцента; ряд других параметров может быть выражен через этот показатель. Параметр аналогичен сложным процентам (например, если удельная скорость роста равна 0,1 ч-1, то увеличение биомассы равно 10 % в час). Таким образом, ростовые процессы приводят к накоплению биомассы.

Эффективность биотехнологического процесса оценивается выходом продукта Y по субстрату («экономический коэффициент»), определяется как количество продукта, получаемого из данного количества субстрата:

Y = X/S0 - S,

где S и S0 - конечная и исходная концентрации субстрата.

Данный коэффициент выражает эффективность использования субстрата для получения целевого продукта и является очень важной характеристикой, так как непосредственно связан с продуктивностью и позволяет влиять на себестоимость конечного продукта.

Кривая роста микроорганизмов в периодических условиях. В биотехнологии большое значение имеет анализ основных закономерностей роста и развития культивируемых микроорганизмов. В его основу положена кривая роста микроорганизмов в простых периодических условиях (рис. 1).

Рис. 1. Кривая роста микроорганизмов: 1 и 2 (лаг-фаза и фаза ускорения роста) - подбор условий культивирования и состава питательной среды; 3 (лог-фаза) - синтез первичных метаболитов, образование биомассы; 4 и 5 (фаза торможения и стационарная) - синтез вторичных метаболитов, «урожай биомассы»; 6 (фаза отмирания) - процессы стерилизации, внутриклеточные метаболиты

Подбор необходимых для культивирования форм микроорганизмов с заданными свойствами включает несколько этапов: выделение микроорганизмов, получение накопительных культур, выделение чистых культур.

1. Выделение микроорганизмов. Отбираются пробы из мест обитания микроорганизмов (почва, растительные остатки и т. д.). Применительно к углеводородокисляющим микроорганизмам таким местом может быть почва возле бензоколонок; винные дрожжи обильно встречаются на винограде; анаэробные целлюлозоразлагающие и метанобразующие микроорганизмы в больших количествах обитают в рубце жвачных животных.

2. Получение накопительных культур. Образцы вносят в жидкие питательные среды специального состава, создают благоприятные условия для развития продуцента (температура, РН, источники энергии, углерода, азота и т. д.). Для накопления

продуцента холестериноксидазы используют среды с холестерином в качестве единственного источника углерода; углеводород окисляющих микроорганизмов - среды с парафинами; продуцентов протеолитических или липолитических ферментов - среды, содержащие белки или липиды.

3. Выделение чистых культур. На плотные питательные среды засевают образцы проб из накопительных культур. Отдельные клетки микроорганизмов на плотных питательных средах образуют изолированные колонии, или клоны, при их пересеве получаются чистые культуры, состоящие из клеток одного вида продуцента. Другой путь подбора микроорганизмов - из имеющихся коллекций. Например, продуцентами антибиотиков чаще являются актиномицеты, этанола - дрожжи. Клон - культура, полученная из одной клетки, чистая культура - совокупность особей одного вида микроорганизмов, штаммы - культуры, выделенные из различных природных сред или из одной среды в разное время.

Контрольные вопросы

1. Перечислите требования, предъявляемые к микроорганизмам-продуцентам метаболитов в биотехнологическом производстве.

2. Назовите 5-7 видов микрооорганизмов, используемых в промышленности для получения целевых продуктов.

3. Назовите критерии оценки эффективности биотехнологических процессов и охарактеризуйте их.

Оформление отчета

Отчет должен содержать:

1. Цель работы.

2. Основную информацию в рекомендованном виде.

3. Описание одного вида микроорганизмов из списка, используемых в промышленности для получения целевых продуктов.