ГЕНЕТИКА - Підручник - А.В. Сиволоб - 2008

РОЗДІЛ 9. Генетична інженерія і методи молекулярної генетики

ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ РОСЛИН

Одна з переваг рослинних клітин - їхня тотипотентність: з однієї клітини можна регенерувати цілу рослину. Отже, із клітин, сконструйованих генно-інженерними методами, можна отримати рослини, усі клітини яких несуть чужорідний ген чи гени. Часто такі трансгенні рослини, створені de novo, розмножують вегетативно. Генетична модифікація рослин може здійснюватись за допомогою спеціальних векторів або шляхом прямого перенесення генів.

Поширеним методом уведення генів у рослинні геноми є використання ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens. Агробактерії мають здатність інтегрувати свій генетичний матеріал у клітини дводольних рослин. Вони містять великі (близько 200 тис. пар основ) Ті-плазміди (tumor inducing), які несуть так звану Т-ДНК - ділянку, здатну інтегруватися в ядерний геном рослинної клітини. До складу Т-ДНК входять гени фітогормонів, продукти експресії яких індукують у трансформованих рослин утворення пухлин - корончастих галів. Гени, що відповідають за перенесення та інтеграцію Т-ДНК у геном рослин (vir-гени), знаходяться в іншій ділянці Ті-плазміди. Трансгенні рослини отримують, використовуючи модифіковану Т- ДНК, в якій онкогени замінені на будь-який ген, котрий бажано інтегрувати в рослинний геном. Таку неонкогенну плазміду конструюють генно-інженерними методами, клонують в E. coli, а потім вектор уводять в A. tumefaciens: vir-гени забезпечують перенесення та інтеграцію бажаної ділянки. За допомогою агробактерій трансформовано велику кількість видів дводольних рослин, однак модифікація однодольних рослин (головні зернові культури - рис, пшениця та кукурудза) таким шляхом ускладнена.

Безвекторні системи дають можливість прямого перенесення чужорідної ДНК у будь-які рослинні клітини або протопласти (клітини, в яких відсутня клітинна стінка). При безвекторному перенесенні використовують методи електропорації, мікроін'єкції та біолістичний метод. Мікроін'єкцію проводять під мікроскопом за допомогою скляної голки, уводячи через неї ДНК у ядро клітини. Бомбардування клітин (біолістика) - інший дуже ефективний метод уведення ДНК у рослинну клітину. При цьому золоті або вольфрамові сферичні кульки діаметром 0,4-1,2 мкм покривають шаром ДНК, яку осаджують СаСІ2, спермідином або поліетиленгліколем, і "вистрілюють" кульками в суспензію клітин зі спеціальної "рушниці". Кульки пробивають клітинну стінку, за рахунок чого ДНК потрапляє всередину клітини та з певною імовірністю інтегрується в рослинну ДНК за допомогою не зовсім зрозумілого механізму. Пряме введення ДНК у протопласти рослин можна здійснити й за допомогою ліпосом - сферичних частинок, мембрани яких містять фосфоліпіди. Частинки обволікають трансформуючу ДНК і тим самим захищають її від нуклеаз. За допомогою ліпосом у протопласти рослин вдається ввести ДНК Ті-плазмід, а також цілі хромосоми.

Для ідентифікації трансформованих клітин і оцінки рівня експресії чужорідних генів на ранніх стадіях отримання трансгенних рослин використовують репортерні гени, продукти яких легко дете- ктуються за допомогою простих методів. Одним із таких генів є ген GUS, що кодує фермент p-D-глюкуронідазу, яка перетворює певний субстрат на сполуку, забарвлену в яскраво-блакитний колір. Інший ген - GFP - кодує флуоресцентний білок, котрий легко детектувати. Як правило, експресія репортерного гена корелює з рівнем експресії функціонального гена в трансгенній рослині. З метою мінімізувати вторгнення а рослинний геном останнім часом розробляються підходи з отримання безмаркерних трансгенних рослин. Наприклад, трансформують рослину двома різними ДНК, одна з яких несе маркерний ген, а інша - трансген, що має бути інтегрованим. У цьому випадку від 30 до 80 % рослин містить обидва гени, які, однак, інтегровані в різні ділянки геному рослини. Після відбору трансформан- тів маркерний ген можна видалити з трансгенної рослини за допомогою звичайного схрещування.

З метою забезпечити високий рівень експресії в рослинному геномі чужорідний ген оснащують сильним конститутивним промотором. Часто використовують, наприклад, так званий ЗББ-промотор - промотор РНК 35S вірусу мозаїки кольорової капусти, який забезпечує експресію в будь-яких геномах рослин. Велике значення мають також тканиноспецифічні промотори рослинних генів. Їхня перевага полягає в тому, що гени, які перебувають під їхнім контролем, експресу- ються тільки в певних тканинах. Так, будь-який ген, контрольований пататиновим промотором, буде експресуватись тільки в бульбах картоплі (пататин - запасний білок бульб картоплі, і тільки тут експресуються його гени). Подібні промотори використовують, коли необхідна експресія гена в певних органах рослин, наприклад - у коренях для захисту від ґрунтових патогенів.

Поліпшення харчових якостей рослин є однією з основних цілей їхньої генетичної модифікації. Так, до складу білків ендосперму зернових культур генно-інженерними методами вводять додаткові амінокислоти, що дозволяє отримувати якісніше зерно. Існують розробки, спрямовані на поліпшення складу жирних кислот олійних культур, а також на гальмування процесу пом'якшення плодів після їхнього дозрівання. Наприклад, таке передчасне пом'якшення томатів зумовлене генами ферментів целюлази й полігалактуронази. Для інактивації вказаних генів за механізмом РНК-інтерференції було

створено трансгенні рослини, в яких синтезувались антизмістовні РНК-версії відповідних мРНК.

Стійкість рослин до біотичних і абіотичних факторів - інша важлива мета генетичних модифікацій. Наразі найширше культивуються трансгенні рослини, що є стійкими до дії гербіцидів і комах. Дія гербіцидів головним чином виявляється в інгібуванні біохімічних процесів фотосинтезу або синтезу амінокислот. З появою технології генетичної трансформації стало можливим убудовувати в рослини гени, які роблять їх нечутливими до таких гербіцидів: після обробки гербіцидом бур'яни гинуть, а трансгенні культури - ні. Сьогодні виведено велику кількість трансгенних рослин, стійких до основних класів гербіцидів. При створенні їх було реалізовано щонайменше три різні підходи: 1) забезпечити синтез білка, чутливого до дії гербіциду, у такій кількості, щоб його вистачило на виконання властивих йому функцій за наявності гербіциду; 2) зменшити здатність білка, чутливого до гербіциду, до зв'язування з ним; 3) забезпечити інактивацію гербіциду в рослині в ході метаболізму.

Використання генної інженерії дозволяє також конструювати рослини, стійкі до комашиних атак. Так, тепер широко використовують гени Bacillus thuringiensis - ґрунтового мікроорганізму, що має здатність у ході споруляції утворювати асоційовані зі спорами кристалоподібні включення, які складаються з так званих Cry-білків - токсинів проти комах. Мінімальний фрагмент гена такого бактеріального токсину, оздоблений сильним промотором, інтегрується в рослинний геном - таким шляхом уже отримано стійкі до комах форми картоплі, томатів, хлопку, кукурудзи тощо. Найважливіше, що при цьому зникає необхідність у використанні інсектицидів. Розроблено також інші системи захисту від комах на основі введення генів інгібіторів протеаз, які блокують гідроліз рослинних білків у траво- ході комахи.

Генетичною інженерією рослин широко послуговуються також для створення культур, стійких до фітопатогенних вірусів, соле- та посухостійких трансгенних рослин. Так, одержано трансгенний рис з інактивованим геном Fad7 (білок, що впливає на метаболізм жирних кислот), який може рости при підвищених температурах і витримувати до двох годин при 47 °С.

Перспективним напрямком є також створення трансгенних рослин, що синтезують цінні речовини. Рослини дають велику кількість біомаси, і, на відміну від рекомбінантних бактерій, для вирощування сільськогосподарських культур не потрібні великі кошти на обладнання та висококваліфікований персонал. Ще одна перевага трансгенних рослин як продуцентів фармакологічних білків - висока якість отриманого продукту й майже повна відповідність систем посттранс- ляційних модифікацій білків до таких, що реалізуються в організмі людини. Сьогодні вже створено трансгенні рослини-продуценти мо- ноклональних антитіл, функціональних фрагментів антитіл, гормонів, цитокінів, факторів росту, інтерферону, інших білків із фармакологічною дією. Загалом, незважаючи на значні досягнення в області продукування рекомбінантних білків медичного значення в рослинах, цей напрямок перебуває лише на початковій стадії свого розвитку. Вважається, що в майбутньому рекомбінантні препарати, які отримуватимуть з генетично модифікованих рослин, замінять на фармацевтичному ринку вартісні аналоги, одержані з тварин і бактерій.