Фізіологія рослин - Мусієнко М.М. 2001

Кореневе живлення рослин
Сучасні уявлення про механізм відновлення молекулярного азоту. Організми, які здійснюють азотфіксацію

Молекулярний азот атмосфери засвоюється лише мікроорганізмами. Відомо два роди архебактерій, 38 родів бактерій та 20 родів ціанобактерій, які здійснюють азотфіксацію. Всі вони одержали назву діазотрофи. Найважливіші з них бактерії родів (Azotobacter, Clostridium), деякі актиноміцети (Frankia), ціанобактерії (Anabaena, Nostoc) та симбіотичні бактерії роду Rhizobium. Недавно виявлено, що до азотфіксації здатні бактерії — метаногени (Methanobacterium), які обумовлюють утворення метану. Необхідно відмітити, що перевірка методом радіоактивних ізотопів не підтвердила здатності до азотфіксації, виділених із грунту видів дріжджів та плісневих грибів, як це вважалося раніше. Серед азотфіксаторів розрізняють:

·вільноживучі організми (Azotobacter, Clostridium);

·симбіотичні асоціації їх з вищими рослинами.

В грунті серед вільноживучих організмів переважають бактерії, а в водному середовищі роль азотфіксаторів належить ціанобактеріям. Як приклад симбіотичних систем можна привести бактерії роду Rhizobium та бобових рослин, асоціативні симбіози між бактеріями та вищими рослинами.

Несимбіотичні бактерії здатні додавати близько 7 кг азоту на гектар ріллі на рік.

Процес засвоєння молекулярного азоту повітря мікроорганізмами називають біологічною азотфіксацією, а відповідні мікроорганізми — азотфіксаторами. З вільноживучих азотфіксаторів досить відомі аеробний Azotobacter та анаеробний Clostridium. Серед симбіотичних — бульбочкові бактерії, особливо роду Rhizobium, які утворюють особливі вирости на коренях бобових рослин. Крім бобових цією здатністю володіють також лишайники, мохи, вільха, обліпиха, деякі папороті, розоцвіті, злаки та осокові.

Здатністю до азотфіксації володіє не сама рослина, а мікроорганізми, що знаходяться з нею в симбіозі (бактерії, актиноміцети, ціанели).

Симбіотичні системи. З сільськогосподарської точки зору ці системи відіграють важливу роль, тому що:

·азот фіксується безпосередньо поблизу до кореневих систем, які так його потребують;

·хоча частина амонію, утвореного в результаті фіксації, і використовується мікросимбіонтом для власного росту і розвитку, все ж більша частина його експортується в клітини господаря.

Розглянемо симбіоз бобових, у яких існує специфічність по відношенню до колонізуючих їх бактерій (роду Rhizobium). Цей вид бактерій існує в усіх грунтах, але у вільному стані вони не здатні до азотфіксації. Бактерії колонізують корені рослин в період появи перших листків. Першим до колонізації кроком є розпізнавання різними видами роду Rhizobium рослини-хазяїна. В цьому процесі важлива роль належить лектинам, специфічним рослинним білкам, які можуть, зв'язуватись із залишками цукрів (вуглеводів), склеюючи поверхні суміжних клітин шляхом сполучення їхніх полісахаридних груп. Ці лектини можуть взаємодіяти із специфічними бактеріями даного роду, що забезпечує рослині пізнавання та контакт з потрібним видом.

Бактерії потрапляють в рослину крізь кореневі волоски, що деформуються під впливом якоїсь гормоноподібної речовини, яка виділяється бактерією. Від місця проникнення бактерій в кореневий волосок розвивається тяж, по якому бактерії рухаються в тканину кореня, розмножуючись при цьому. Після заселення рослини одним штамом інші уже в нього не проникають (звідси, з практичної точки зору, виникає потреба мати найефективніші азотфіксуючі штами).

Заселення клітин кореня рослини-хазяїна розпочинається після звільнення бактерій із тяжа і пов’язане з діяльністю двох ферментів, які гідролізують клітинну стінку. Це пектиназа з клітин бактерій та целюлаза з клітин рослин. Вони сприяють проникненню бактерій в клітини рослин, де продовжують ділитися. Рослинна клітина збільшується в розмірах, переповнюється бактеріями, змінює свою будову та функцію, перетворюючись на бактероїд, що і відповідає за азотфіксацію.

Одночасно з проникненням бактерій в клітину рослини-хазяїна розпочинається активне ділення інфікованих клітин та сусідніх неінфікованих, що сприяє поширенню бактерій і зумовлює формування кореневих бульбочок, характерних для симбіотичних асоціацій (рис. 132).

Причому внутрішня частина інфікованих та неінфікованих клітин завжди оточена кортикальним шаром незаражених клітин хазяїна.

Рис. 132. а— бульбочки на коренях сої (Glycine max), що утворюються в результаті симбіотичних взаємовідношень між кореневими клітинами цієї рослини родини бобових та бактеріями роду Rhizobium, фіксують азот; б, в — мікрофотографії бульбочок конюшини повзучої (Trifolium repens), зроблені за допомогою скануючого електронного мікроскопа

Інфіковані частини внутрішньої зони зрілої кореневої бульбочки можуть містити один або кілька бактероїдів. Вони оточені мембранною оболочкою, в якій, можливо, локалізований червоний пігментний білок — фітоглобін (по типу гемопротеїду крові — гемоглобін, м’язів — міоглобін, в рослин — фітоглобін). Він утворюється лише в фіксуючих азот бульбочках і знаходиться в інфікованих клітинах, становлячи до 30-40% всього розчинного білка клітини. Його синтез кодується ДНК геному клітини хазяїна, а не ДНК бактерій.

Допускають, що в бактероїдах функціонує, ймовірно, вмонтований у мембрану дихальний ланцюг, близький за будовою до класичного ланцюга перенесення електронів мітохондрій та спряжене з ним фосфорилування. Цей ланцюг бере участь в синтезі АТФ, яка так необхідна при азотфіксації.

Отже, щоб симбіотична система могла фіксувати азот, необхідно: утворення кореневих бульбочок, диференціація бактерій в бактероїди та утворення фітоглобіну. Фіксація продовжується до старіння бульбочок, а деякі з них живуть до початку нового вегетаційного періоду.

Симбіози водоростей виникають при асоціації синьозелених з вищими рослинами. Однак, на відміну від Rhizobium та актиноміцетів, які вступають в симбіоз з квітковими рослинами, ціанобактерії вступають в симбіоз з нижчими формами (лишайниками, печіночниками та ін.).

Сучасні уявлення про відновлення молекулярного азоту. Хоч нас оточує океан молекулярного азоту, молекула азоту настільки міцно зв’язана, що для розриву трьох ковалентних зв’язків потрібно 940 кДж/моль. Тому технічний синтез аміаку потребує температуру порядку 500 °С та тиск 300-350 атм., тоді як мікроорганізми-азотфіксатори функціонують у звичайних умовах. Це пояснюється тим, що вони мають специфічні ефективні ферментні системи, що каталізують окремі процеси азотфіксації.

Саме тому проблема біологічної фіксації азоту займає значне місце в наукових лабораторіях світу. Слід підкреслити, що в усіх різноманітних азотфіксаторах знаходиться та сама ферментна система, _;яка каталізує перетворення молекулярного азоту в аміак.

Це ферментний комплекс — нітрогеназа, яку вперше одержав Карнахан (Carnachan et al., 1960) із сухих клітин, Clostridium pasterianum, в лабораторії фірми Дюпон в США. Встановлено, що нітрогеназа складається з двох білків - азобілку(Fе-білок) та молібдобілок (Mo-Fe-білок):

Перший з них має молекулярну масу (м. м.) 56000-67000, є димером, до складу його входить негемінове залізо, тобто залізо, зв'язане безпосередньо з сіркою білка. Другий, молібдобілок, тетрамер, має 4 субодиниці, м. м. 200 000 270 000, крім негемінового заліза має в своєму складі 2 атоми молібдену. В даний час виділено і досліджено обидва білки нітрогенази із ряду мікроорганізмів.

Для відновлення одного моля азоту потрібно 12-16 АТФ, тобто 4-5 АТФ на пару електронів, перенесену в процесі відновлення від відновника на азот. Насправді ж витрати енергії перевищують ці величини і досягають до 30-40 молів АТФ на моль фіксованого азоту. Джерелом електронів (фередоксини, флаводоксини) та АТФ служать процеси фотосинтезу, дихання та бродіння.

Для функціонування ферменту необхідно утворення комплексу між залізобілком та молібдозалізобілком у співвідношенні 1:1. Комплекс двох компонентів нітрогенази існує лише в період поєднаного з гідролізом АТФ перенесення електронів від азобілку до молібдену молібдобілку. Енергія, необхідна для функціонування нітрогенази надходить не від вільної АТФ, а від комплексу Mg-АТФ, який зв’язується із залізобілком. Цікаво, що Fe-білок сформований із двох субодиниць так, що між ними є щілина, в яку, ймовірно, і заходить молекула АТФ.

Молібдобілок існує в трьох різних станах, причому кожен із них характеризується певною часткою відновлення атомів заліза в молекулі. Хоча механізм азотфіксації повністю не розкритий, вважають, що саме молібдобілок реагує з потенціальним субстратом нітрогенази N₂ внаслідок зв’язування його атомами молібдену даного білка (рис. 133). Схематично процес фіксації включає відновлення атомів заліза в азобілку, в результаті чого АТФ гідролізується до АДФ та Ф_н. Електрон атома заліза в молібдобілку використовується для відновлення зв’язаного з останнім субстрату. Повинно відбуватися кілька таких переносів, перш ніж фермент виділить кінцевий відновлений продукт амоній. Перенесення електронів супроводиться гідролізом АТФ.

Рис. 133. Азотфіксація в бактероїдах. Окислення малату в циклі Кребса дає п'ять НАД×Н і один ФАД×Н₂. Синтех двох молекул NH₃ з N₂ супроводжується відновленням 2Н⁺ до Н₂ з витратою 16 молекул АТФ. Синтез цих АТФ локалізований в дихальному ланцюгу бактероїдної мембрани і проходить за рахунок окислення восьми молекул НАД×Н. На кожну молекулу фіксованого N₂ витрачається чотири молекули О₂ для окислення НАД×Н в дихальному ланцюгу бактероїдної мембрани

Слід пам’ятати, що фермент нітрогеназа руйнується (дезактивується) при контакті з О₂. Саме тому факультативні азотфіксатори фіксують азот лише в анаеробних умовах. Аеробним азотфіксаторам (азотобактер) для підтримання високої інтенсивності дихання та забезпечення синтезу АТФ потрібні значні витрати О₂. Саме тому, можливо, це і є перешкодою для надходження O₂ в центри азотфіксації, що не впливає на дію ферменту. Інша гіпотеза передбачає, що ймовірно захист нітрогенази здійснюють асоційовані з нею білки, зокрема, за рахунок конформаційних змін.

Вільноживучі ціанобактерії фіксують азот в гетероцистах, товста клітинна стінка яких захищає від доступу кисню. Симбіотичні ж організми для регуляції концентрації О₂ в зоні фіксації азоту мають специфічну систему — фітоглобін, який синтезує рослина-хазяїн. Він досить чутливий до О₂ і тому попереджає накопичення кисню. Будучи синтезованим клітиною рослини- хазяїна, він монтується в мембрану бактероїда і забезпечує транспортування О₂ до бактероїда, створюючи таким чином захисний ефект для нітрогенази.

Отже, бактероїд слід розглядати як високоспеціалізований компартмент, який створює середовище, де фіксація азоту та окислювальні процеси фізіологічно сумісні. Цикл Кребса, який функціонує в бактероїді, служить джерелом субстратів для окислення в ЕТЛ, що забезпечує синтез АТФ, постачає нітрогеназу електронами через фередоксин та кетокислоти для утворення амінокислот, що транспортуються потім в клітини рослини-хазяїна.

Регуляція нітрогенази. Щодо витрати енергії нітрогеназу слід вважати економічно не вигідним ферментом, адже для підтримання її активності потрібна АТФ. Тому азотфіксуючі організми виробили способи регуляції синтезу та активації нітрогенази.

Здатністю фіксувати азот керує набір генів, відомих як гени фіксації азоту (nif). Вільноживучі азотфіксатори синтезують аміак одночасно з процесами біосинтезів бактеріальної клітини, тому він практично засвоюється і не виділяється в навколишнє середовище. При наявності в грунті зв’язаного азоту (NH₄⁺, NO₃ ), який може бути використаний для ростових процесів в клітині, nif-гени репресовані і нітрогеназа не утворюється.

Навпаки, в деяких бактерій-симбіонтів, наприклад Rhizobium, nif-гени в нормі дерепресовані, в результаті чого нітрогеназа утворюється та зберігає свою активність навіть при наявності амонію, а фіксований азот виділяється в цитоплазму клітин-хазяїна. В такій симбіотичній асоціації дерепресія nif-генів зумовлює фіксацію значних кількостей атмосферного азоту.

Іншим способом регуляції фіксації азоту в симбіозі може бути постачання АТФ. Воно потрібне для активації ферменту, а як показали досліди "in vitro», АДФ пригнічує його активність. Є дані, що в регуляції транскрипції генів нітрогенази бере участь глутамінсинтетаза — фермент, який забезпечує в клітині асиміляцію аміаку з утворенням глутаміну. Цей фермент існує в активній (деаденільованій) формі та неактивній (аденільованій). При високому вмісті амонію клітина аденілює глутамінсинтетазу і таким чином інактивує її, що спричинює виключення транскрипції генів азотфіксації.

Регуляція активності глутамінсинтетази шляхом аденілування (ковалентне приєднання 5-АМФ до гідроксильних груп тирозильних залишків на субодиницях глутамінсинтетази) здійснюється опосередковано через зміну активності аденілтрансферази, яка каталізує реакції аденілування та деаденілування. В тому випадку, коли дана реакція не регулюється, виникає цикл, який спричинює флуктуацію глутамінсинтетаз між активною та неактивною формами, а отже зайвий гідроліз АТФ. Цьому процесу можна запобігти за допомогою дії так званих регуляторних білків, які існують в комплексі з АТФ-азою також в двох формах.

Існують й інші способи клітинного контролю над експресією генів азотфіксації.