Фізіологія рослин - Мусієнко М.М. 2001

Фотосинтез: фізіолого-біохімічні та екологічні аспекти
Темнова стадія фотосинтезу. Вщновлювальний пентозофосфатний цикл

Всі живі організми мають лише один первинний механізм карбоксилування. Первинний в тому розумінні, що він породжує усе інше. Це шлях біосинтезу усіх вуглецевмісних органічних сполук із СО2, який відомий під назвою циклу Кальвіна, або відновлюючого пентозофосфатного циклу (ВПФ-цикл). Універсальність цього циклу свідчить про те, що він виник в організмах значно примітивніших, ніж евкарютичні водорості та рослини. Фотосинтезуючі бактерії (за винятком ціанобактерій), які здійснюють фоторедукцію, в деяких випадках здатні фіксувати та відновлювати СО2.

Розчинні кофактори НАДФ×Н та АТФ (продукти світлової стадії) використовуються як джерело відновних еквівалентів та енергії для перетворення СО2 в фосфати цукрів у хлоропластах. Ферменти, які каталізують окремі реакції ВПФ-циклу, розчинні у воді та локалізовані в стромі хлоропластів.

В самому ВПФ-циклі немає фотохімічних реакцій, однак світлові стадії можуть непрямим шляхом впливати на нього. Наприклад, це спостерігається шляхом зміни під впливом освітлення концентрації водневих іонів, магнію, рівня відновленості кофакторів, таких як фередоксин та НАДФ. Послідовність реакцій розшифрував у США М. Кальвін із співробітниками протягом 1946-1956 рр. (рис. 70). Цю працю було відзначено у 1961 р. Нобелівською премією.

Механізм асиміляції СО2 було розшифровано завдяки застосуванню міченого за 14С вуглекислого газу, хроматографічного та радіоавтографічного методів аналізу. Як об’єкт досліджень було використано зелену одноклітинну водорость — хлорелу. Після короткочасної експозиції на світлі в присутності 14СО2 рослини фіксувалися гарячим спиртом. Спиртовий екстракт концентрувався, а потім розділявся на хроматограмах. Було виявлено, що вже через 5 секунд перебування в атмосфері 14СО2 більша частина радіоактивного вуглецю зосереджується в тривуглецевій сполуці — 3-фосфогліцериновій кислоті (З ФГК). Тому було припущено, що в хлоропластах повинна бути певна сполука-акцептор, яка, взаємодіючи з 14СО2, утворює фосфогліцеринову кислоту (акцептор + 14СО2 = ФГК). Було виявлено, що після виключення освітлення, вміст ФГК деякий час продовжував зростати. Одночасно спостерігалось досить швидке зникнення п’ятивуглецевої сполуки — рибулозобісфосфату. Проте вже через 30 секунд рибулозобісфосфат зникав, тоді як кількість ФГК не змінювалась на цей момент. Разом з тим на світлі рибу- лозобісфосфат не зникав і його вміст залишався постійним. Зовсім інша картина спостерігалась при відсутності вуглекислого газу. Тоді ні в темряві, ні на світлі вміст рибулозобісфосфату не змінювався. З цього випливає, що в присутності вуглекислого газу рибулозобісфосфат в темряві використовувався для утворення ФГК. Подальше перетворення ФГК вимагає наявності світла. Проаналізувавши одержані дані М. Кальвін запропонував наступний хід подій в темнову фазу фотосинтезу.

Рис. 70. Цикл Кальвіна-Бенсона-Бассема (ВПФ-цикл). Кількість ліній в стрілках вказує, скільки разів повторюється реакція за один повний оберт циклу, в якому три молекули СО2 перетворюються на молекулу ФГА

На першому етапі відбувається карбоксилування первинного акцептора вуглекислого газу — рибулозобісфосфату (РуБФ). Цю реакцію приєднання каталізує фермент рибулозобісфосфаткарбоксилазаоксигеназа (РУБІСКО), найпоширеніший білок в біоті, який активується магнієм. Її константа Міхаеліса для СO2 in vitro складає 450 мкмоль. Це відповідає парціальному тиску в 1-2% СO2 при pH 7,5. При концентрації СО2 рівній 0,03% (реальний вміст його в атмосферному повітрі) фермент карбоксилювання виявляється навіть недовантаженим. Не ясно, наскільки це має місце в тканинах листка in vivo. Інша, досить суттєва особливість даного ферменту, є сильна залежність способу дії даного ферменту від O2 (цю залежність ми розглянемо в розділі «Фотодихання»).

Спочатку виникає шести вуглецева молекула (3-карбоксі-3-кето-арабінітол-1,5-бісфосфат), яка нестабільна, тому швидко гідролітичним шляхом розкладається на дві тріози — 2 молекули фосфогліцеринової кислоти (ФГК):

Далі відбувається відновлення ФГК до фосфогліцеринового альдегіду (ФГА) за рахунок асиміляційної енергії світлової стадії. Це відбувається в два етапи: спочатку з допомогою АТФ та ФГК-кінази відбувається додаткове фосфорилування з утворенням 1,3-ФГК:

На другому етапі 1,3-ФГК відновлюється до 3-фосфогліцеринового альдегіду (З ФГА) за участю НАДФ×Н2. Реакція каталізується гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназою і це єдина відновлювальна реакція циклу:

Цей процес легко зворотній на світлі. Сам фермент активується світлом за допомогою так званої системи «медіаторів дії світла", зокрема системою фередоксин/тіоредоксин. Фосфогліцериновий альдегід за участю ферменту тріозофосфатізомерази легко ізомеризується в дигідроацетонфосфат (ДГАФ):

У циклі Кальвіна значна частина тріозофосфатів (ФГА, ДГАФ) використовується у формі ДГАФ, тому в стані рівноваги цієї реакції 95% всіх тріозофосфатів знаходиться у вигляді ДГАФ. Фосфогліцериновий альдегід є фосфорильованою похідною цукрів і має лише три атоми вуглецю, тоді як найпростіші вуглеводи рослин зустрічаються у вигляді гексоз. Для синтезу їх дві молекули ФГА або інших тріоз (ФГА, ДГАФ) повинні приєднатися «голова до голови». Каталізує цю реакцію фермент фруктозобісфосфатальдолаза:

Як правило, при кожному оберті цикла Кальвіна дві молекули ФГА перетворюються на ДГАФ, а потім в присутності альдолази ФГА та ДГАФ конденсуються до фруктозо-1,6-бісфосфату. Після дефосфорилування фруктозо-6-фосфат може виводитися з циклу та використовуватися для синтезу сахарози або інших поліцукрів. Крім того, через процеси дихання вони включаються в побудову вуглецевих скелетів багатьох інших органічних речовин.

Для того, щоб фотосинтетична фіксація СO2 відбувалася без зупинки, первинний акцептор мусить регенеруватись з такою ж швидкістю, з якою він використовується. Тому мусить існувати механізм регенерації. І насправді, в циклі на третьому етапі п’ять молекул тріозофосфатів перетворюється на три молекули первинного акцептора: 5С3→ЗС5. Для цього відбувається кілька реакцій ізомеризації та молекулярних перебудов. Слід зазначити, що всі реакції проходять на одному енергетичному рівні без додаткових витрат АТФ.

Спочатку за участю транскетолази з Ф-6-Ф та ФГА синтезуються 4-вуглецевий еритрозо-4- фосфат (Е-4-Ф) та 5-вуглецевий ксилулозо-5-фосфат (Ксу-5-Ф):

У цій реакції фосфогліцериновий альдегід реагує з еквімолярною кількістю фруктозо-6- фосфату, в результаті утворюється однакова кількість 4- та 5-вуглецевих цукрів:

С6 + С3→ С4 + С5

Потім еритрозо-4-фосфат реагує з однаковою кількістю ДГАФ за участю альдолази. Продуктом такої альдольної конденсації є седогептулозо-1,7-бісфосфат (Су-1,7-БФ):

Потім СБФ за участю СБФ-фосфатази дефосфорилується до седогептулозо-7-фосфату (Су-7-Ф):

Ця реакція вважається тією ланкою циклу, яка лімітує швидкість перебігу даного ВПФ-цик- лу, тому бере участь в його регуляції.

Наступна реакція відбувається знову за участю транскетолази, в якій із седогептулозо-7-фос- фагу та фосфогліцеринового альдегіду утворюється ксилулозо-5-фосфат та рибозо-5-фосфат:

У цій реакції транскетолаза переносить двовуглецевий фрагмент на фосфогліцериновий альдегід, але вже не від фруктозо-6-фосфату, а від седогептулозо-7-фосфату, чим і пояснюється факт утворення у цьому випаду двох пентоз:

Це свідчить про те, що молекула фосфогліцеринового альдегіду може використовуватися в циклі Кальвіна чотирма різними способами. Так завершується перетворення 5 молекул ФГА в 3 молекули пентоз.

Нарешті дві молекули ксилулозо-5-фосфату (Ксу-5-Ф) перетворюються на рибулозо-бісфосфат за участю фермента рибозофосфатепімерази:

Цей фермент каталізує по-суті реакцію ізомеризації, але субстрат та продукт є епімерами, які відрізняються один від одного лише орієнтацією водневого атома та гідроксильної групи біля третього вуглецевого атома.

Синтезований підчас циклу рибозо-5-фосфаттакож ізомеризується дорибулозо-5-фосфату за участю ферменту рибулозофосфатізомерази:

Таким чином, на завершальному етапі фермент фосфорибулокіназа забезпечує фосфо- рилування рибулозо-5-фосфату за участю АТФ світлової стадії, і утворюється знову первинний акцептор вуглекислого газу рибулозо-1,5-бісфосфат. Ця реакція і завершує цикл Кальвіна:

Автокаталіз. Реакцію, яка дає більше субстрату, ніж використовує його, називають автока- талітичною, бо її швидкість зростає із збільшенням концентрації субстрату. На кожні три молекули СO2, які включаються в ВПФ-цикл, утворюється одна молекула продукту — тріозофосфату. Він може перетворюватися на крохмаль, сахарозу і т. ін., а також використовуватись на регенерацію акцептора СO2, стимулюючи тим самим утворення проміжних продуктів, тобто цикл функціонує таким чином, що він продукує більше акцептора, ніж використовує. Якби в процесі циклу регенерувалось стільки ж субстрату, скільки використовується, то рослинний організм не мав би здатності рости та пристосовуватися до більш сприятливих умов посиленням інтенсивності фотосинтезу. Зелена рослина на сьогодні єдина, яка має можливість за допомогою ВПФ-циклу перетворювати фотосинтетичний продукт у додатковий субстрат.

Отже, в процесі циклу 6 СО2 перетворюються в фруктозо-6-фосфат, використовуючи для цього 12 НАДФ×Н та 18 АТФ. Для асиміляції молекули СО2 потрібно 2НАДФ×Н та ЗАТФ. Реальні витрати дещо більші в зв’язку з фотодиханням, в ході якого втрачається певна його частина. Загальне сумарне рівняння темнової фази наступне:

Утворений тріозофосфат (ФГА) вступає в наступну стадію утворення кінцевих продуктів фотосинтезу. Звідси можна розрахувати енергетичний баланс циклу Кальвіна. Для відновлення шести молекул вуглекислого газу до рівня вуглеводів (С6Н12О6) потрібно 18 молекул АТФ і 12НАДФ×Н2. Відповідно для відновлення до рівня вуглеводів однієї молекули СO2 необхідно три молекули АТФ і дві НАДФ×Н2. Нам відомо, що на утворення двох молекул НАДФ×Н2 і двох молекул АТФ необхідно 8 квантів світла. Решта АТФ утворюється в ході циклічного фотофосфо- рилування. Значить, для відновлення однієї молекули вуглекислого газу до рівня вуглеводів необхідно мінімум 8-9 квантів. Енергія квантів червогого світла рівна 168 кДж на моль. Таким чином, при використанні червоних променів на відновлення однієї молекули СO2 до рівня вуглеводів витрачається приблизно 1340-1508 кДж. З цієї енергії в одну шосту молі гексози відкладається 478 кДж. Коефіцієнт корисної дії фотосинтезу в даному випадку становить приблизно 30-35%. Однак в природних умовах коефіцієнт використання світла значно менший. Шлях вуглецю при фотосинтезі, встановлений Кальвіном, є основним. Однак існують відхилення від даного шляху.