Фізіологія рослин - Мусієнко М.М. 2001

Фізіологія рослин та біотехнологія. Досягнення і перспективи розвитку
Кріобанк клітин та меристем як шлях до збереження біологічного різноманіття видів

В умовах глобальної екологічної кризи збереження генофонду живих систем має першочергове значення і цю проблему включено в ряд міжнародних програм. Єдиним засобом необмежено тривалого збереження штамів клітин, тканин та мікроорганів є кріозбереження. Термін «кріозбереження" (cryopreservation) застосовують для позначення складного багатоетапного процесу, який дослідник проводить з метою необмежено довго зберегти стабільними живі клітини, тканини і органи в стані анабіозу (рис. 213).

Актуальність надійного збереження активно метаболічних клітин рослин в незмінному стані важко переоцінити, адже клітинні штами уже часто заміняють рослинну сировину на біотехнологічних заводах, культура тканин дозволяє одержувати самоклональні варіанти — нове джерело генетичного різноманіття для селекції рослин, а ембріони і особливо апікальні меристеми забезпечують регенерацію рослин, які є точними копіями вихідних. Саме тому кріозбереження стає способом збереження генофонду не лише культури клітин, а й рослин з вегетативним розмноженням та інших. Цей процес досить простий лише для достатньо зневоднених об’єктів (пилок, ортодоксальне насіння), які можна прямо занурювати в рідкий азот з наступним розморожуванням на повітрі в звичайних умовах Щодо оводнених клітин, тканин та органів рослин кріозбереження є вкрай екстремальним процесом і розпочинається, як правило, з етапу підготовки (спеціальне попереднє культивування), а закінчується рекультивуванням, яке забезпечує інтенсивний поділ клітин. Такий процес вважають успішним за умов відновлення росту культури.

Глибоке охолодження рідким азотом (-196 °С), зберігання та розморожування є стресовим фактором для клітини. Основне значення тут відіграє процес утворення кристалів льоду та зневоднення клітин, тому потрібна спеціальна підготовка клітин та меристем, застосування ефективних кріопротекторів та відповідна програма заморожування.

Найефективнішими кріопротекторами виступають диметилсульфоксид, гліцерин, пролін, цукроза. Оптимізація умов потрібна не лише для певного виду клітин, а навіть для певних штамів. Доведено, що рекультивовані після збереження клітинні культури женьшеню, діоскореї, моркви в основному ідентичні й придатні для біотехнології. Вони зберігають швидкість росту, морфогенетичний потенціал, а щодо меристем картоплі, то вже вдається регенерувати рослини, які дають врожаї. Успішного кріозбереження клітинних та тканинних культур in vitro досягнуто на сучасному етапі для 60-65 видів, з яких близько 30 — культури меристем.

Рис. 213. Основні етапи біотехнологічного процесу кріоконсервації генетичних ресурсів рослин

Збереження генетичних ресурсів шляхом кріоконсервування меристем має багато переваг порівняно із іншими способами in vitro. Це пояснюється тим, що меристеми розвиваються безпосередньо в рослини, що забезпечує велику генетичну стабільність. До того ж вони легко витримують заморожування, бо мають дрібні клітини, в яких немає великих вакуолей.

На відміну від традиційних способів зберігання, кріоконсервація має істотні переваги, бо вона виключає можливість таких процесів, як втрата запасних речовин, нагромадження токсинів, розпад та інактивація ферментативних комплексів, самоокислення ліпідів, деградація функціональних та генетичних систем, а також ряд інших процесів, пов’язаних із старінням клітини.

Саме тому праці по збереженню генетичного різноманіття біосфери з допомогою кріоконсервації генетичних ресурсів рослин набувають інтенсивного розвитку.

Останнім часом у працях з клітинної селекції при культивуванні тканин використовують метод кріоконсервації недозрілих зародків рослин (ембріони). Потреба такої кріоконсервації зумовлена тим, що в стиглому насінні зародки досить стабільні і не піддаються мутагенним впливам. Тому у працях з генної інженерії мутагенні фактори використовують для впливу на незрілі ембріони. Метод кріоконсервації забезпечує тривале зберігання їх, а значить і використання клітинної селекції, що істотно прискорює селекційний процес.

Створення іфіобанку клітин та меристем забезпечить зберігання існуючого генофонду, але в перспективі потрібні глибокі фізіолого-біохімічні дослідження з метою оптимізації глибокого заморожування для конкретних штамів, сортів і видів.

Основні труднощі пов’язані із специфікою як самих рослинних клітин (великі розміри — до 2000 мкм, значна вакуолізація), так і їх популяцій in vitro. Клітини в таких популяціях генетично гетерогенні, асинхронні, частина їх виходить з мітотичного циклу в фазу G₀. В кожній культурі клітини мають фізіологічні та морфологічні варіації, що впливає на кріостійкість їх, і тому далеко не всі клітини витримують кріозбереження. Фізіологічне та морфологічне різноманіттях ще більше зростає у клітин різних штамів, тим більше у клітин різних видів.

У випадку меристематичних культур ситуація додатково ускладнюється. Кожна меристема є, по суті, мікроорганом розміром в середньому 500 мкм, в якому поряд з дрібними клітина-

ми власне меристем, що діляться, наявні клітини інших тканин, що знаходяться на різних стадіях диференціювання, часто витягнуті та вакуолізовані неоднаковою мірою. Кріостійкість таких клітин набагато менша, ніж власне меристематичних.

Взаємодія клітин, зокрема детермінованих в примордії і власне меристематичних, має вирішальне значення для всієї меристеми. Якщо взаємодія в процесі кріоконсервації збереглась, тобто відповідні клітини вижили, то меристема регенерує рослину, якщо ж ні, то одержується неорганізований ріст, тобто утворюється калус. З нього теж можна регенерувати рослину, але такий шлях небажаний для кріозбереження меристем, бо при регенерації через калус немає впевненості в абсолютно точному відтворенні вихідного генотипу. Тому потрібні спеціальні дослідження регенерованих рослин, щоб встановити ідентичність їх до вихідних.

Отже, завдання кріозбереження апікальних меристем не зводиться до збереження лише власне меристематичних клітин. Головна мішень кріопошкоджень — плазмалема і її зміни пов’язані з порушенням неперервності структури її ліпідного шару. Тому в процесі кріоконсервації поряд з природними процесами кріостійкості рослинних клітин використовується весь арсенал підготовки та штучного кріозахисту. Саме клітини, тканини та апікальні меристеми при їхній культурі in vitro дозволяють зробити кріозбереження універсальним способом збереження генофонду, поширивши його на види рослин з рекальцитратним насінням і на види, які розмножуються лише вегетативно.