БИОХИМИЯ - Л. Страйер - 1984

ТОМ 3

Часть IV ИНФОРМАЦИЯ

ГЛАВА 28. РЕГУЛЯЦИЯ ВЫРАЖЕНИЯ ГЕНА В ФЕНОТИПЕ

28.2. Открытие регуляторного гена

Ключом к изучению механизма индукции β-галактозидазы стало открытие того факта, что под действием всех исследованных индукторов количество пермеазы и трансацетилазы возрастало прямо пропорционально количеству β-галактозидазы. Дальнейший прогресс был достигнут при изучении мутантов. Оно показало, что в-галакто- зидаза, пермеаза и трансацетилаза кодируются тремя генами - z, у и а соответственно - которые расположены друг за другом. Были получены мутанты, утратившие способность к синтезу одного из этих белков. Например, генотип z^-y⁺a⁺ обозначает, что у данного мутанта нет β-галактозидазы, но имеются в нормальном количестве пермеаза и трансацетилаза. Наибольший интерес представляет Класс мутантов, у которого мутацией затронуты все три белка. Такие конститутивные мутанты синтезируют без всякого индуктора большие количества в-галактозидазы, пермеазы и трансацети- лазы. Франсуа Жакоб и Жак Моно (Francois Jacob, Jacques Monod) пришли к выводу, что скорость синтеза этих трех белков зависит от какого-то общего элемента, отличного от генов, кодирующих их последовательности. Ген этого общего регуляторного элемента был обозначен ¡. Индуцибельные Бактерии дикого типа имеют генотип i⁺z⁺ y⁺a⁺, а конститутивные мутанты по лактозным генам - генотип i^-z⁺y⁺a⁺.

Каким образом осуществляется влияние гена; на Скорость синтеза белков, кодируемых генами z, у и а? Проще всего было предположить, что ген; кодирует синтез некоего компонента цитоплазмы, названного репрессором, которого либо совсем нет в i-клетках, либо он там неактивен. Эта идея была проверена в ряде изящных генетических экспериментов с частично диплоидными бактериями, имевшими два набора генов лактозной области. Один набор содержался в бактериальной хромосоме, а второй - в половом факторе F', введенном в клетку при конъюгации. Например, был получен диплоид i⁺z⁺ Fi^-z⁺. У этого диплоида гены i⁺ z^- находятся в хромосоме, а гены i^-z⁺ в эписоме. Является ли этот диплоид индуцибельным или конститутивным в отношении β-галактозидазы? Другими словами, может ли ген ¡⁺ бактериальной хромосомы подавлять экспрессию гена z⁺, расположенного в эписоме? Эксперимент дал совершенно четкий результат: диплоид индуцибелен, а не конститутивен. Такой же результат был получен и в отношении диплоида i^-z⁺/Fi⁺z^-. Следовательно, ген; кодирует способный к диффузии репрессор.

28.3. Оперон - единица координированной генетической экспрессии

На основе только что описанных экспериментов Жакоб и Моно постулировали модель оперона, объясняющую регуляцию белкового синтеза. Генетические элементы этой модели - регуляторный ген, операторный ген и набор структурных генов (рис. 28.3). Регуляторный ген продуцирует репрессор, который может взаимодействовать с операторным Геном. В дальнейшем выяснилось, что репрессор представляет собой белок. Операторный ген расположен рядом по соседству со структурными генами, которые он контролирует. Связывание репрессора с операторным геном препятствует транскрипции структурных генов. Операторный ген в совокупности со структурными генами, рядом с которыми он расположен, называется опероном. В случае лактозного оперона ген i - регуляторный ген, ген о - ген-оператор, а гены z, у и а - структурные гены. Кроме того, существует еще промоторный участок (обозначаемый символом р) для связывания РНК-полимеразы. Этот участок инициирования транскрипции расположен перед операторным геном. Индуктор, например, изопропилтиогалактозид (ИПТГ), связывается с репрессором и тем самым нарушает его взаимодействие с операторным геном. Теперь гены z, у и а могут транскрибироваться. При этом образуется одна длинная молекула РНК, кодирующая все три белка (рис. 28.4). Молекулу мРНК, кодирующую более одного белка, называют полицистронным (или полигенным) транскриптом.

Class="center">Рис. 28.3. Карта лактозного оперона и его регуляторного гена. В карте масштаб не соблюден: участки р и о в действительности гораздо меньше, чем кодирующие участки генов

Рис. 28.4. Схема лактозного оперона в репрессированном (А) и индуцированном (Б) состояниях

28.4. lас-Репрессор - тетрамерный белок

При выделении репрессора лактозного опeрона (/ас-репрессор) была использована его способность связываться с ИПТГ. Уолтер Гилберт и Бенно Мюллер-Хилл (Walter Gilbert, Benno Muller-Hill) установили, что /ас-репрессор - белок, который связывается с ДНК, содержащей /ас-Оперон, но не связывается ни с одной другой ДНК. Как и предполагалось, ИПТГ подавляет связывание /ас-репрессора с /ас-операторной ДНК. Клетка Е. co/i дикого типа содержит всего около десяти молекул /ас-репрессора. При очистке репрессора возникли трудности, связанные с тем, что он составляет всего 0,001% общего содержания белка. Однако существуют i^eg-мутанты, имеющие, по-видимому, более эффективный промотор гена i. У этих мутантов образуется гораздо больше /ас-репрессора. Количество /ас-репрессора увеличивается еще сильнее, если использовать трансдуцирующие фаги, несущие область /ас. Зараженные таким фагом Клетки Е. coli содержат около 20 000 молекул репрессора (примерно 2% всего белка). Это прекрасный исходный материал для выделения /ас-репрессора.

Рис. 28.5. Электронная микрофотография /ас-репрессора, связанного с ДНК, содержащей lас-оператор

Репрессор - тетрамер из идентичных субъединиц с массой 37 кДа, каждая из которых имеет один участок связывания с индуктором. Константа диссоциации ИПТГ составляет примерно 10^-6 М. Репрессор очень прочно и быстро связывается с оператором. Константа диссоциации комплекса репрессор-оператор составляет примерно 10^-13 М. Такое высокое сродство обусловлено тем, что в клетке Е. coli дикого типа содержится всего несколько молекул репрессора. Константа скорости ассоциации поразительно высока - 7 • 10⁹ м^-1 • с^-1. Из этого следует, что репрессор находит операторный участок, диффундируя вдоль молекулы ДНК (одномерный поиск), а не ищет его, находясь в водной среде (трехмерный поиск)¹.

¹ Недавно проведенные исследования показали, что ситуация намного сложнее: поиск оператора репрессором включает оба указанных механизма и в очень большой степени зависит от ионного состава среды. Прим. перев.