Підручник - БІОЛОГІЧНА ХІМІЯ - Губський Ю.І. - 2000

Розділ II. ЗАГАЛЬНІ ЗАКОНОМІРНОСТІ МЕТАБОЛІЗМУ

ГЛАВА 8. ОБМІН РЕЧОВИН: КАТАБОЛІЗМ, АНАБОЛІЗМ

8.2. МЕТОДИ ВИВЧЕННЯ ОБМІНУ РЕЧОВИН

Для вивчення обміну речовин використовують різноманітні хімічні, фізико-хімічні та фізичні методи, що дозволяють ідентифікувати певні метаболіти, оцінювати їх перетворення, біологічне значення для здійснення окремих фізіологічних функцій усього організму, спеціалізованих тканин (м’язової, нервової, сполучної тощо), окремих клітин та субклітинних структур.

Сучасними методами розподілу, очищення складних біологічних сумішей та виділення з них окремих сполук є хроматографія — іонообмінна, абсорбційна, розподільна, гель-хроматографія, афінна (біоспецифічна) — та електрофорез. Із метою вивчення структури біомолекул застосовують інфрачервону та ультрафіолетову спектроскопію, спектроскопію електронного парамагнітного та ядерного магнітного резонансів, флуоресцентний та рентгеноструктурний аналіз.

Окремі метаболічні шляхи містяться у визначених внутрішньоклітинних ділянках — компартментах, що відокремлені біологічними мембранами, зокрема:

- в ядрах — реакції біосинтезу (реплікації) ДНК, синтезу інформаційних та інших класів РНК (транскрипції);

- в мітохондріях—реакції циклу трикарбонових кислот, β-окислення жирних кислот, електронного транспорту та окисного фосфорилювання;

- в цитоплазмі (цитозолі) — реакції гліколізу, глюконеогенезу, синтезу жирних кислот, обміну амінокислот тощо;

- в рибосомах—реакції білкового синтезу (утворення поліпептидних ланцюгів);

- у мембранах ендоплазматичного ретикулуму — цитохром Р-45О-залежні процеси окисного гідроксилювання гідрофобних субстратів ендогенного та екзогенного походження (реакції “мікросомального окислення”);

- у лізосомах — реакції гідролітичного розщеплення біополімерів — білків та нуклеїнових кислот (як власних біомолекул, так і чужорідних сполук, що поглинаються певними клітинами за рахунок ендоцитозу).

Для вивчення біохімічних реакцій та окремих метаболітів, які локалізовані в певних клітинних компартментах, використовують метод диференційного центрифугування. Сутність методу полягає в послідовному центрифугуванні з різними швидкостями гомогенатів біологічних тканин (печінки, м’язів, мозку тощо), що містять у собі суспендовані субклітинні структури (ядра, мітохондрії, лізосоми, різні мембранні везикули, рибосоми). Для отримання гомогенату тканину дезінтегрують у спеціальному гомогенізаторі, суспендуючи її в біологічно інертному розчині (О,25 М розчин сахарози, сольові розчини). Залежно від розмірів та маси, означені органели осідають (седиментують) з різною швидкістю, тому, застосовуючи різну швидкість обертання ротору ультрацентрифуги (та, відповідно, збільшуючи фактор седиментації, що кількісно визначається в одиницях прискорення земного тяжіння — g) досягають фракціонування тканинного гомогенату на окремі субклітинні структури — табл. 8.1.

Таблиця 8.1. Субклітинні структури, що виділяються за умов фракціонування тканинних гомогенатів методом диференційного центрифугування

Фактор седиментації

Фракція

Склад фракції, маркерні ферменти

600 g

Ядерна

Клітинні ядра; ДНК- та РНК-полімерази

10 000 g

Мітохондріальна

Мітохондрії; ферменти циклу трикарбонових кислот, біологічного окислення та окисного фосфорилювання

12-16 000 g

Лізосомальна

Лізосоми; кислі гідролази

100 000 g

Мікросомальна

Везикули ендоплазматичного ретикулума, рибосоми; ферменти окисного гідроксилювання, біосинтезу білка

Супернатант

Надосадова фракція

Розчинні ферменти цитозолю