Биохимия и молекулярная биология - Белясова Н.А. 2002

Молекулярные основы и механизмы наследственности
Организация генетического аппарата клетки
Становление постулата «ДНК - носитель генетической информации»

Развитие представлений о ДНК как о веществе, в котором зашифрована наследственная информация клетки, осуществлялось в истории биохимии на протяжении примерно двадцати лет в ходе нескольких этапов. Причиной такого длительного спора между исследователями в отношении одного из главных вопросов естествознания послужила, с одной стороны, консервативность взглядов на структуру нуклеиновых кислот как на «просто организованные молекулы». При недостаточной их изученности полагалось, что ДНК и РНК представляют собой полимеры, в которых многократно повторяются тетрануклеотиды. В то же время белковые молекулы стали исследоваться раньше других клеточных макромолекул, и к 1928 г. в изучении их организации удалось достичь определенного прогресса: было известно, что в их составе присутствует, как минимум, 20 аминокислот, которые чередуются в произвольном порядке, определяя огромное количество вариантов строения полипептидов.

История становления постулата «ДНК - носитель наследственной информации» показательна с точки зрения изящества человеческой мысли, а также проливает свет на многие закономерности процессов наследования признаков организмами и достойна изучения.

Первым прямым доказательством генетической роли ДНК послужили эксперименты Ф. Гриффита (1928 г.) по трансформации пневмококков. Гриффит работал с двумя типами штаммов Diplococcus pneumoniae: S-формами, образующими на агаризованных средах гладкие, блестящие (от англ. smooth — гладкий) колонии, и R-формами, характеризующимися шероховатой (от англ. rough — шероховатый) поверхностью колоний. S-формы были высоковирулентными для мышей и вызывали у них пневмонию. Однако убитые нагреванием до 65° С, пневмококки S-формы не приводили к болезни и гибели мышей. R-формы были низковирулентными и редко вызывали заболевание мышей.

Гриффит обнаружил, что если мышей заразить смесью живых R-форм и убитых нагреванием (до 65° С) S-форм, то животные заболевают, а из их крови можно выделить жизнеспособные S-формы пневмококков, причем того же серотипа, что и убитые нагреванием S-формы. Это наблюдение позволило Гриффиту сделать вывод о явлении «трансформации» в организме мыши бактерий одного типа (R) в бактерии другого типа (S), а трансформирующим фактором в этом случае должно было выступать вещество, определяющее наследственные свойства и содержащееся в убитых нагреванием клетках. Поскольку при используемой температуре (60—65 °С) белок подвергается денатурации, Гриффит предположил, что трансформирующим фактором, очевидно, является не белок, а ДНК.

Со времен экспериментов Гриффита данный метод переноса генетической информации называется трансформацией. Позже стало известно, что характер клеточной поверхности пневмококков определяется двумя аллелями гена: аллель S контролирует способность клетки формировать полисахаридную капсулу, придающую гладкую поверхность колониям и защищающую пневмококков от иммунной системы мыши; если в клетке присутствует аллель R, то капсула не образуется, и клетки легко распознаются и уничтожаются иммунной системой хозяина.

В свое время результаты экспериментов и выводы Гриффита, как выходящие за рамки традиционных представлений об этих процессах, не были приняты научной общественностью. Понадобилось воспроизведение похожих манипуляций in vitro, которое осуществили в 1944 г. американские исследователи Эвери, Мак-Леод и Мак-Карти. Эти ученые трансформировали растущую культуру пневмококков R-типа выделенной из клеток S-штамма ДНК. Оказалось, что некоторые бактерии приобретали способность синтезировать полисахаридную капсулу и, соответственно, патогенность для мышей. При этом единственным фактором, способным сообщить R-клеткам данное свойство, была очищенная ДНК. Кроме того, в данных экспериментах было выявлено, что на трансформацию не оказывают влияния протеолитические ферменты, и наоборот, обработка трансформирующего фактора нуклеазами приводила к предотвращению процесса трансформации. Наконец, из экспериментов следовало, что возникающие в результате трансформации бактерии S-типа обладают способностью передавать приобретенное свойство (синтез капсульных полисахаридов) дочерним клеткам. Полученные американскими учеными доказательства роли ДНК в хранении и передаче наследственной информации носили фундаментальный характер и вошли в историю, однако и они не были оценены сразу по указанным выше причинам. Кроме того, изучение основ наследственности в 1944 г. только начиналось и еще не было точно установлено, что бактерии обладают генами, во всех отношениях сходными с генами высших организмов.

Решающим доказательством в пользу генетической роли ДНК стали эксперименты, осуществленные Альфредом Херши и Маргарет Чейз в 1952 г. Им удалось доказать, что носителем наследственной информации у бактериофага Т2 является ДНК. Суть экспериментов сводилась к следующему. Одну культуру клеток кишечной палочки выращивали на среде, содержащей радиоактивные изотопы фосфора (³²Р), а другую — в присутствии изотопов серы (³⁵S), в результате чего эти изотопы включались в содержимое клеток. Затем каждую из меченых бактериальных культур использовали для получения лизата Т2. Получали разные лизаты меченных изотопами фагов: в одном из них содержались частицы Т2, у которых ³⁵S включался в состав белка (капсида), а в другом - Т2 с ³²Р в составе ДНК. Радиоактивные метки позволяли проследить пути белка и ДНК фага при его репродукции.

Литический цикл начинается с прикрепления фаговой частицы к клеточной поверхности, и через определенное время фаговая ДНК инъецируется в клетку. Это подтверждалось результатами центрифугирования суспензий на отмеченных стадиях: вначале вместе с бактериями осаждались и фаги (³⁵S и ³²Р регистрировался в осадке). Однако через определенное время бульшая часть меченного изотопом серы белка может быть отделена от клеток при встряхивании суспензии, при этом бульшая часть меченной изотопом фосфора ДНК не отделяется от бактерий и обнаруживается в осадке. Это дает основание предполагать, что ДНК оказывается уже внутри клеток.

Удаление из культуры пустых фаговых оболочек («теней») не оказывает влияния на дальнейшие события: бактерии лизируются, и из них выходит фаговое потомство точно так же, как и в случае, если «тени» остаются на поверхности клеток. Оказалось, что удаление «теней» сопровождается удалением не менее 80 % ³⁵S, а основная масса ³²Р остается в клетках и в дальнейшем (при репродукции фага) передается потомству. Таким образом, очевиден вывод, что именно ДНК, а не белок определяет процесс репродукции фага в клетках.

Эксперимент Херши и Чейз послужил решающим доказательством генетической роли ДНК и привлек внимание к работам, выполненным на пневмококках несколькими годами ранее. Этому способствовало несколько причин: к 1952 г. исследование структуры нуклеиновых кислот достигло больших успехов и было опровергнуто представление об этих молекулах как о консервативных; данный эксперимент был осуществлен на бактериофаге, относительно характера наследования признаков которого было хорошо известно, что он аналогичен таковому для высших организмов; наконец, для фага Т2 было продемонстрировано существование мутаций и так же, как у высших организмов, описана рекомбинация мутантных генов.

Дополнительным доказательством генетической роли ДНК явилось обнаружение инфекционных свойств у очищенного препарата ДНК вируса табачной мозаики.